SPA-EGFP融合蛋白在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及其在免疫診斷中的應(yīng)用.pdf

1、免疫熒光測(cè)定法(immunofluorescence assay，IFA)在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究中的應(yīng)用已有近60年的歷史，其原理就是將抗原抗體反應(yīng)的特異性和敏感性與顯微示蹤的精確性相結(jié)合，以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體，對(duì)組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原物質(zhì)進(jìn)行定位檢測(cè)。然而，傳統(tǒng)熒光染料在熒光顯微鏡激發(fā)光照射下易發(fā)生光漂白現(xiàn)象，而且傳統(tǒng)抗體制備及標(biāo)記方法易降低抗體效價(jià)并產(chǎn)生非特異性染色。因此開發(fā)新的熒光標(biāo)記物及標(biāo)記方法是很有意義的。近年來(lái)，關(guān)于綠色熒光蛋白(gr

2、eenfluorescent protein，GFP)融合單鏈抗體(single-chain variable fragment，scFv)檢測(cè)相應(yīng)抗原的報(bào)道很多，但每檢測(cè)一種抗原就要制備相應(yīng)的融合抗體且敏感性較差。葡萄球菌蛋白A(staphylococcal protein A，SPA)具有和人等多種動(dòng)物IgG結(jié)合的能力，被稱為“廣泛二抗”，可為多種標(biāo)記物所標(biāo)記，已廣泛用于各種免疫測(cè)定技術(shù)的間接法。用SPA代替scFv與GFP融合表達(dá)

3、將有望得到一種新型免疫熒光檢測(cè)試劑以彌補(bǔ)以上不足。 基于以上設(shè)想，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了spa與egfp融合基因的原核分泌表達(dá)載體pEZZl8/egfp，并在大腸桿菌(Ecoli DH5α)中成功表達(dá)，得到的融合蛋白既有熒光活性又有IgG結(jié)合活性，但原核分泌表達(dá)存在分泌效率低、胞內(nèi)表達(dá)產(chǎn)物分離純化步驟繁瑣且信號(hào)肽不能有效切除等問題。本研究在前期工作基礎(chǔ)上將spa-egfp融合基因轉(zhuǎn)入畢赤酵母(Pichiapastor GSll5)進(jìn)

4、行分泌表達(dá)，克服了上述缺點(diǎn)，并初步研究了表達(dá)產(chǎn)物SPA-EGFP作為一種新型免疫熒光檢測(cè)試劑在免疫診斷方面的應(yīng)用表現(xiàn)。 本研究通過PCR技術(shù)從質(zhì)粒pEZZl8/egfp)中擴(kuò)增出spa-egfp融合基因，再將其克隆至畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K中，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pPIC9K/spa-egfp，并測(cè)序鑒定。重組質(zhì)粒經(jīng)SalI線性化后，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSll5，經(jīng)組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基(MD平板)和YPD-G418平板篩

5、選得到高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子，PCR鑒定，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。培養(yǎng)上清經(jīng)SDS-PAGE分析顯示，誘導(dǎo)表達(dá)蛋白的表觀分子量約為43kD，與預(yù)期的融合蛋白分子量相近，初步驗(yàn)證了融合蛋白的分泌表達(dá)。通過比較不同G418抗性工程菌的表達(dá)量，確定最佳表達(dá)菌株為1.5mg/L G418抗性的工程菌，誘導(dǎo)84h時(shí)表達(dá)量最高。通過正交設(shè)計(jì)對(duì)影響畢赤酵母表達(dá)量的幾個(gè)因素水平進(jìn)行優(yōu)化，確定添加磷酸鉀緩沖液使培養(yǎng)基pH值保持7.0，同時(shí)添加1％的Casamino ac

6、ids，目的蛋白的表達(dá)量提高了341.4％，達(dá)到107mg/L，占培養(yǎng)上清總蛋白的70％以上。培養(yǎng)上清經(jīng)鎳柱親和層析一步純化后得到的蛋白在SDS-PAGE上顯示為約43kD的單一條帶，純度達(dá)95％以上。該蛋白的熒光激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜經(jīng)測(cè)定與EGFP基本一致；競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)還顯示該蛋白具有IgG結(jié)合活性，以上均說明融合蛋白SPA-EGFP在畢赤酵母中的分泌表達(dá)獲得成功，與原核表達(dá)比較，表達(dá)量得到大幅度提高，信號(hào)肽能有效切除，分離純

7、化步驟簡(jiǎn)單易行。 免疫熒光測(cè)定法在臨床上已用作病原體的檢驗(yàn)及自身免疫性疾病的診斷等。本研究以純化的融合蛋白SPA-EGFP替代FITC標(biāo)記的羊抗人IgG抗體，用于抗細(xì)胞核抗體(ANA)的間接免疫熒光檢測(cè)、天皰瘡抗體的直接免疫熒光檢測(cè)、抗肺炎支原體IgG抗體的間接免疫熒光檢測(cè)均獲得良好的結(jié)果，初步驗(yàn)證了其作為一種新型免疫熒光檢測(cè)試劑在免疫熒光測(cè)定中應(yīng)用的可行性及優(yōu)勢(shì)。 本研究取得的主要成果有： (1)成功構(gòu)建