重組米曲霉單寧酶在畢赤酵母中的分泌表達與性質分析.pdf

1、該研究嘗試用畢赤酵母表達系統(tǒng)進行單寧酶的分泌表達,將來自于米曲霉的單寧酶基因克隆到畢赤酵母表達載體pPIC9K中,構建成分泌型表達載體pPIC9K-TAN,然后轉化到畢赤酵母菌株KM71中,得到的His<'+>菌株再用G41 8篩選抗性克隆,然后進行搖瓶表達,探討了在不同pH條件下進行誘導以及不同甲醇濃度對單寧酶表達量的影響.鑒于畢赤酵母適合于高密度發(fā)酵的特點,我們還進行了重組單寧酶的高密度發(fā)酵表達.發(fā)酵液上清經超慮濃縮后用DEAE陰離

2、子交換層析純化,每升發(fā)酵液可得約72mg單寧酶樣品.對重組單寧酶進行去糖基化分析,從SDS-PAGE分析結果顯示,在去糖基化后進行非還原性電泳時,單寧酶的遷移率大約為68kDa,而在進行還原性電泳時,則清楚顯示出重組單寧酶由34kDa和31kDa兩個亞基構成.我們還對重組單寧酶的酶學性質進行了分析,測定重組單寧酶的酶活力為1.5×10<'4>U/g.并對其熱穩(wěn)定性范圍,最適反應溫度,酸堿穩(wěn)定范圍,最適反應pH等進行了分析.由于甲醇具有一

3、定的毒性,且是易燃物質,存在一定的危險性,而組成型啟動子P<,GAP>是近年來成功克隆并得以應用的畢赤酵母高效啟動子,為了探討使用該啟動子表達單寧酶的可行性,并探討載體信號肽序列與單寧酶基因之間的序列對單寧酶的表達及其N端序列的影響,我們構建了表達載體pGAPZαA-TAN及pGAPZαA-ETAN,其中pGAPZαA-TAN中信號肽序列與單寧酶基因直接相連,在pGAPZαA-ETAN中,信號肽序列與單寧酶基因之間保留了Ste13蛋白酶