黑曲霉阿魏酸酯酶基因在畢赤酵母及黑曲霉中的高效表達(dá).pdf

1、半纖維素是纖維素外植物細(xì)胞壁中含量最豐富的組份。半纖維素中50％的成份是木聚糖。木聚糖骨架的降解依賴兩大類酶：內(nèi)切木聚糖酶和β-木糖苷酶。內(nèi)切木聚糖酶（EC3.2.1.8）可將木聚糖骨架降解成較小的低聚糖，這些低聚糖在β-木糖苷酶（EC3.2.1.37）的作用下降解成木糖。除了這兩大類酶發(fā)揮主導(dǎo)作用外，其他一些酶類也參與了木聚糖的降解，如阿魏酸酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯糖酶、α-葡萄糖醛酸酶和對(duì)香豆酸酯酶，其中阿魏酸酯酶發(fā)揮關(guān)鍵作用。

2、它能夠水解植物細(xì)胞壁大分子之間通過阿魏酸或雙阿魏酸形成的酯鍵，導(dǎo)致植物細(xì)胞壁復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的破壞，使得其他水解酶更容易接近底物的作用中心。阿魏酸酯酶在飼料、食品、生物能源、化妝和醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
　　基于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)黑曲霉（Aspergillus niger）阿魏酸酯酶A的序列設(shè)計(jì)引物，以A. niger h408染色體DNA為模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，P

3、CR）獲得其阿魏酸酯酶A的全基因。DNA序列分析顯示A. niger faeA（AnfaeA）全基因的長(zhǎng)度為903bp，含有兩個(gè)外顯子，1個(gè)內(nèi)含子。采用重疊延伸PCR技術(shù)成功克隆得到A. niger h408阿魏酸酯酶 A的cDNA基因（GenBank:KF911349）。測(cè)序結(jié)果顯示黑曲霉faeA cDNA序列為783bp，含有1個(gè)開放閱讀框架（ORF），編碼260個(gè)氨基酸。Blast分析顯示該基因和GenBank中黑曲霉阿魏酸酯酶序

4、列同一性為99%，翻譯的氨基酸序列含有脂酶典型的活性蓋子和催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)。
　　將 AnfaeA基因和畢赤酵母表達(dá)載體 pPIC9K連接，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-Anfae，重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)SacI線性化后電轉(zhuǎn)化Pichia pastoris GS115，實(shí)現(xiàn)了黑曲霉阿魏酸酯酶A基因在P. pastoris GS115中的高效表達(dá)。平板透明圈法篩選到5株阿魏酸酯酶活性高的轉(zhuǎn)化子，1株編號(hào)為pPIC9K-Anfae5的轉(zhuǎn)化子阿魏

5、酸酯酶活性最高，酶活達(dá)24.72U/mL，比活力為40.84U/mg，比黑曲霉出發(fā)菌株（22.1mU/mL）提高了1100倍左右。SDS-PAGE分析顯示重組酶的分子量為33kDa，超出預(yù)期分子量28kDa。重組阿魏酸酯酶性質(zhì)研究表明：其最適pH為5.0，且在pH4-9穩(wěn)定性較好；最適反應(yīng)溫度50℃，在40-50℃時(shí)較穩(wěn)定。
　　對(duì)重組畢赤酵母 pPIC9K-Anfae5進(jìn)行了發(fā)酵條件優(yōu)化，最佳的發(fā)酵條件為：接種量在5%-10%之

6、間；初始生長(zhǎng)pH及誘導(dǎo)pH為6.0左右；甲醇誘導(dǎo)濃度為1%，誘導(dǎo)時(shí)間為84h。在搖瓶誘導(dǎo)培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，對(duì)重組菌進(jìn)行了50L和500L的發(fā)酵中試實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：處于對(duì)數(shù)初期時(shí)即可檢測(cè)到阿魏酸酯酶活，隨發(fā)酵的進(jìn)行酶活迅速升高，當(dāng)菌體處于平穩(wěn)期（84h）時(shí)酶活達(dá)到最高，分別為102.1U/mL、121.8U/mL，比搖瓶發(fā)酵的酶活提高了5倍左右。此后隨時(shí)間延長(zhǎng)，酶活趨于平穩(wěn)，菌體密度開始下降，因此選用84h（甲醇誘導(dǎo)56h）作為發(fā)酵終止點(diǎn)。重

7、組畢赤酵母的中試為該酶的工業(yè)化積累了數(shù)據(jù)和經(jīng)驗(yàn)。
　　畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)阿魏酸酯酶的活性雖高，但是產(chǎn)酶品種單一，體外復(fù)合酶終究不如絲狀真菌本身酶系齊全和比例適當(dāng)，因此進(jìn)行了阿魏酸酯酶在黑曲霉出發(fā)菌株中的表達(dá)。選用黑曲霉烯醇化酶基因的啟動(dòng)子（Peno）作為fae表達(dá)盒的啟動(dòng)子，深綠木霉丙酮酸脫酸化酶基因（Tpdc）的終止子作為fae表達(dá)盒的終止子，構(gòu)建Peno-fae-Tpdc（PFT）表達(dá)盒，與潮霉素抗性質(zhì)粒pAN7-1共轉(zhuǎn)化黑曲霉原

8、生質(zhì)體，實(shí)現(xiàn)了AnfaeA在黑曲霉出發(fā)菌株中的組成性表達(dá)。經(jīng)抗性復(fù)篩得到19株具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，在阿魏酸乙酯平板上有透明圈的有7株轉(zhuǎn)化子。通過PCR驗(yàn)證7株轉(zhuǎn)化子的基因組中均已經(jīng)整合了構(gòu)建的PFT表達(dá)盒。對(duì)7株重組子進(jìn)行了發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，其中一株編號(hào)為pft-4的轉(zhuǎn)化子酶活最高，達(dá)567.46mU/mL，比相同培養(yǎng)條件下黑曲霉h408發(fā)酵提高了約251倍，尤其是產(chǎn)酶最高峰從第7d縮短至48h。7株轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵液酶活高低不一，可能是目的基