豬IFN-γ在畢赤酵母中的分泌表達與功能驗證.pdf

1、豬伽馬干擾素（porcine InterferonGamma，pIFN-γ）屬于Ⅱ型干擾素中的唯一成員，主要是由活化的T細胞和NK細胞產(chǎn)生的一種具有廣譜抗病毒活性和免疫調(diào)節(jié)功能的細胞因子。研究和構(gòu)建能高效表達具有高活性、易純化的pIFN-γ基因工程菌，開發(fā)pIFN-γ相關藥物，對于改善當前我國生豬養(yǎng)殖中存在的抗生素濫用、補充有效抗病毒抗腫瘤藥物和提高豬肉品質(zhì)具有重大意義。
　　本研究以NCBI上公布的pIFN-γ的mRNA序列NM

2、_213948為表達基因，以甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母X33為表達宿主，并對pIFN-γ基因序列進行優(yōu)化，先后兩次構(gòu)建了pIFN-γ畢赤酵母分泌表達載體pPICZαA-pIFN-γ、pPICZαA-pIFN-γ-his tag和pIFN-γC末端突變體畢赤酵母分泌表達載體pPICZαA-pIFN-γˊ、pPICZαA-pIFN-γˊ-his tag，通過SDS-PAGE和Western-blot來分析pIFN-γ的表達情況。結(jié)果，第一次表達中得

3、到的pIFN-γ-his tag蛋白無法經(jīng)Western-blot檢測與Ni親和層析柱純化；而第二次表達中得到的pIFN-γ肽鏈C末端突變體pIFN-γ′-his tag，成功通過了Western-bolt檢測和Ni親和層析柱純化；將先后兩次構(gòu)建表達得到的4種蛋白，同時進行SDS-PAGE，發(fā)現(xiàn)四種蛋白的分子量大小關系為：pIFN-γˊ-his tag﹥pIFN-γˊ﹥pIFN-γ-his tag≈pIFN-γ。由此推測，第一次構(gòu)建的p

4、IFN-γ分泌表達載體未能分泌表達得到具有完整C端的pIFN-γ，而第二次構(gòu)建的pIFN-γ突變體分泌表達載體成功分泌表達得到具有完整C端的pIFN-γ′。
　　將本研究表達得到的pIFN-γ、pIFN-γ-his tag及其肽鏈C末端突變體pIFN-γˊ、pIFN-γˊ-his tag純化后，分別與仔豬空腸上皮細胞IPEC-J2共培養(yǎng)，通過RT-qPCR分析受IFN-γ調(diào)控的下游基因Mx1和OAS1、以及不受IFN-γ調(diào)控的基因

5、PKR的表達情況，比較四種蛋白對IPEC-J2細胞的刺激活性差異。結(jié)果表明，四種蛋白均能極顯著的提高Mx1和OAS1的表達水平，均不能顯著提高PKR的表達水平；突變后的蛋白比沒突變的蛋白對Mx1和OAS1的表達水平上調(diào)幅度更大，差異極顯著。由此說明，經(jīng)過突變表達載體表達的pIFN-γ′比突變前具有更強的細胞刺激活性。經(jīng)測定，本研究篩選得到的pIFN-γ′-his tag畢赤酵母高產(chǎn)菌株目的蛋白產(chǎn)量達到了536.4 mg/L，取得了令人滿