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文檔簡介
1、豬伽馬干擾素(porcine InterferonGamma,pIFN-γ)屬于Ⅱ型干擾素中的唯一成員,主要是由活化的T細胞和NK細胞產(chǎn)生的一種具有廣譜抗病毒活性和免疫調(diào)節(jié)功能的細胞因子。研究和構(gòu)建能高效表達具有高活性、易純化的pIFN-γ基因工程菌,開發(fā)pIFN-γ相關藥物,對于改善當前我國生豬養(yǎng)殖中存在的抗生素濫用、補充有效抗病毒抗腫瘤藥物和提高豬肉品質(zhì)具有重大意義。
本研究以NCBI上公布的pIFN-γ的mRNA序列NM
2、_213948為表達基因,以甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母X33為表達宿主,并對pIFN-γ基因序列進行優(yōu)化,先后兩次構(gòu)建了pIFN-γ畢赤酵母分泌表達載體pPICZαA-pIFN-γ、pPICZαA-pIFN-γ-his tag和pIFN-γC末端突變體畢赤酵母分泌表達載體pPICZαA-pIFN-γˊ、pPICZαA-pIFN-γˊ-his tag,通過SDS-PAGE和Western-blot來分析pIFN-γ的表達情況。結(jié)果,第一次表達中得
3、到的pIFN-γ-his tag蛋白無法經(jīng)Western-blot檢測與Ni親和層析柱純化;而第二次表達中得到的pIFN-γ肽鏈C末端突變體pIFN-γ′-his tag,成功通過了Western-bolt檢測和Ni親和層析柱純化;將先后兩次構(gòu)建表達得到的4種蛋白,同時進行SDS-PAGE,發(fā)現(xiàn)四種蛋白的分子量大小關系為:pIFN-γˊ-his tag﹥pIFN-γˊ﹥pIFN-γ-his tag≈pIFN-γ。由此推測,第一次構(gòu)建的p
4、IFN-γ分泌表達載體未能分泌表達得到具有完整C端的pIFN-γ,而第二次構(gòu)建的pIFN-γ突變體分泌表達載體成功分泌表達得到具有完整C端的pIFN-γ′。
將本研究表達得到的pIFN-γ、pIFN-γ-his tag及其肽鏈C末端突變體pIFN-γˊ、pIFN-γˊ-his tag純化后,分別與仔豬空腸上皮細胞IPEC-J2共培養(yǎng),通過RT-qPCR分析受IFN-γ調(diào)控的下游基因Mx1和OAS1、以及不受IFN-γ調(diào)控的基因
5、PKR的表達情況,比較四種蛋白對IPEC-J2細胞的刺激活性差異。結(jié)果表明,四種蛋白均能極顯著的提高Mx1和OAS1的表達水平,均不能顯著提高PKR的表達水平;突變后的蛋白比沒突變的蛋白對Mx1和OAS1的表達水平上調(diào)幅度更大,差異極顯著。由此說明,經(jīng)過突變表達載體表達的pIFN-γ′比突變前具有更強的細胞刺激活性。經(jīng)測定,本研究篩選得到的pIFN-γ′-his tag畢赤酵母高產(chǎn)菌株目的蛋白產(chǎn)量達到了536.4 mg/L,取得了令人滿
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