豬α干擾素在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及其免疫佐劑功能研究.pdf

1、我國(guó)是一個(gè)養(yǎng)豬大國(guó)，但目前有多種傳染病嚴(yán)重危害著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，影響了我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展和豬肉的對(duì)外貿(mào)易。因此，急需研制出安全、高效、新型的抗病毒和免疫增強(qiáng)劑用于增強(qiáng)豬體的抵抗力和提高現(xiàn)有疫苗的保護(hù)率。干擾素(Interferon，IFN)是動(dòng)物機(jī)體感染病毒或接種疫苗后產(chǎn)生的一類具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)功能的蛋白質(zhì)，是動(dòng)物抵御病毒入侵的第一道防線。根據(jù)干擾素的氨基酸序列、抗原性和細(xì)胞來(lái)源的不同可將其分為2個(gè)型：Ⅰ型干擾素的主要成員為α干擾素

2、和β干擾素，Ⅱ型干擾素為γ干擾素。Ⅰ型干擾素具有較強(qiáng)的抗病毒功能，Ⅱ型干擾素抗病毒功能稍弱，但免疫調(diào)節(jié)功能較強(qiáng)。人類重組干擾素用于治療病毒感染和腫瘤疾病已有幾十年的成功歷史。近年來(lái)，豬干擾素(Porcine interferon，PoIFN)的抗病毒和疫苗佐劑功能也在更多的試驗(yàn)中被發(fā)現(xiàn)和證實(shí)。本研究的目的就是應(yīng)用基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)研制出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的重組豬α干擾素并研究其抗病毒和免疫佐劑功能，為我國(guó)重組豬干擾素的工程化生產(chǎn)及其

3、在養(yǎng)豬業(yè)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 將豬α干擾素(PoIFNα)基因克隆入畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPICZα-A中，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33菌株，抗生素ZeocinTM濃度梯度篩選高抗性轉(zhuǎn)化子，以PCR鑒定陽(yáng)性重組菌株。篩選出的高拷貝重組菌株分別通過(guò)BMGY/BMMY培養(yǎng)，用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)獲得重組PoIFNα表達(dá)產(chǎn)物，經(jīng)微量細(xì)胞病變抑制試驗(yàn)(MDBK-VSV系統(tǒng))檢測(cè)，表達(dá)產(chǎn)物的抗病毒活性為2×10<'6>U/mL。 為了探討酵母

4、表達(dá)的豬α干擾素的抗病毒活性，本研究試驗(yàn)了重組豬α干擾素在MDBK細(xì)胞、PK-15細(xì)胞和Marc-145細(xì)胞上對(duì)水皰性口炎病毒的抗病毒效價(jià)，同時(shí)探討重組豬α干擾素對(duì)豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)和偽狂犬病毒(PRV)的抗病毒效果。結(jié)果顯示，重組豬α干擾素在MDBK細(xì)胞上對(duì)VSV病毒的抗病毒效價(jià)最高，約為106.5U/mL,比重組豬α干擾素在Marc-145細(xì)胞和PK-15細(xì)胞上對(duì)VSV病毒的抗病毒效價(jià)要高100～1000倍，推測(cè)不

5、同細(xì)胞上豬α干擾素受體的分布具有較大的差異。偽狂犬強(qiáng)毒株RA株和天然弱毒株Bartha株在1000U/mL豬α干擾素處理的PK-15上的增殖均被顯著抑制，病毒TCID<,50>下降約10倍，但強(qiáng)弱毒之間的敏感性沒有明顯差異。豬α干擾素對(duì)豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)和偽狂犬病毒(PRV)在細(xì)胞上的增殖具有顯著的抑制效果，可使病毒TCID<,50>下降約100倍。PRRSV VR2332株和國(guó)內(nèi)JS06分離株對(duì)豬α干擾素的敏感性沒有

6、明顯差異?？傊?，重組豬α干擾素顯示了良好的抗病毒活性。研究評(píng)估酵母表達(dá)的PCV2 Cap蛋白在豬體的免疫特性以及豬α干擾素對(duì)其的免疫佐劑效果。將酵母表達(dá)的PCV2 Cap蛋白濃縮后，配比適量的鋁膠或重組豬α干擾素制成亞單位疫苗。試驗(yàn)仔豬分組后分別免疫鋁膠亞單位疫苗和添加豬α干擾素的鋁膠亞單位疫苗，同時(shí)設(shè)攻毒對(duì)照與空白對(duì)照，首免后21天加強(qiáng)免疫一次，二免疫后14天用PCV2 JS攻毒。鋁膠Cap蛋白亞單位疫苗免疫豬體后產(chǎn)生了PCV2特異性

7、中和抗體。添加豬α干擾素亞單位疫苗組仔豬免疫后產(chǎn)生的ELISA抗體和中和抗體顯著高于鋁膠亞單位疫苗組仔豬。攻毒對(duì)照組的4只仔豬攻毒后全都產(chǎn)生了病毒血癥，并有較長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)熱；鋁膠亞單位疫苗組4頭仔豬中只有1頭仔豬產(chǎn)生病毒血癥，添加豬α干擾素亞單位疫苗組的仔豬攻毒后都沒有產(chǎn)生病毒血癥。綜合分析試驗(yàn)豬的病毒感染、臨床表現(xiàn)和生產(chǎn)性能等情況表明Cap蛋白亞單位疫苗具有免疫保護(hù)效果，豬α干擾素可顯著增強(qiáng)Cap蛋白亞單位疫苗接種仔豬的體液免疫反應(yīng)，提