重組畢赤酵母遺傳穩(wěn)定性的研究及其表達(dá)產(chǎn)物豬α干擾素的分離與純化.pdf

1、本研究分為兩部分，第一部分圍繞與重組菌遺傳穩(wěn)定性相關(guān)的指標(biāo)進(jìn)行了研究，包括提取酵母基因組進(jìn)行PCR鑒定、菌體生長(zhǎng)狀況（OD600）及蛋白表達(dá)量，同時(shí)研究了不同溫度對(duì)表達(dá)過(guò)程中蛋白穩(wěn)定性的影響。實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的重組體畢赤酵母（外源基因PoIFN-a、宿主細(xì)胞KM71H、表達(dá)載體pPICZαA）進(jìn)行了50次的搖瓶傳代，以及在生長(zhǎng)相的培養(yǎng)和誘導(dǎo)相的表達(dá)來(lái)獲得了宿主菌菌體生長(zhǎng)情況（OD600）和蛋白表達(dá)量的數(shù)據(jù)，以這兩個(gè)指標(biāo)為依據(jù)從外在

2、方面初步判斷菌種活力及目的基因是否存在。結(jié)果表明，不管是原始保存的菌株（S）還是經(jīng)多次發(fā)酵表達(dá)后的菌株（N）在經(jīng)過(guò)一個(gè)適應(yīng)階段后生長(zhǎng)情況都趨于穩(wěn)定，其中多次發(fā)酵后的菌體OD600大多在10～22之間，原始菌株OD600在19～25之間，前者比后者略低但差異不明顯（P>0.05），表明菌種活力良好。蛋白表達(dá)方面，兩組菌種在搖瓶條件下蛋白表達(dá)量都約為1g/L左右，經(jīng)SDS-PAGE電泳和銀染染色證實(shí)目的蛋白主要在16KD左右。為使實(shí)驗(yàn)結(jié)果具

3、有可靠性，實(shí)驗(yàn)提取了不同代次酵母基因組DNA，PCR擴(kuò)增后電泳條帶大小和預(yù)期相同，測(cè)序證明確實(shí)為目的基因，從而證明目的基因（PoIFN-α）在體內(nèi)穩(wěn)定存在。最后為確定不同溫度及表面活性劑對(duì)蛋白穩(wěn)定性的影響，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了兩個(gè)不同誘導(dǎo)溫度（20℃和30℃）作為比較，結(jié)果表明20℃誘導(dǎo)條件下目標(biāo)蛋白主要以完整（21KD）和降解形式存在，30℃條件下以降解形式存在，濃度測(cè)定結(jié)果表明前者約是后者的兩倍，證實(shí)溫度是影響蛋白表達(dá)穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素，降低溫

4、度不僅能有效抑制蛋白的降解而且可提高表達(dá)量。
　　 第二部分對(duì)5L發(fā)酵罐發(fā)酵后的上清進(jìn)行了分離純化，分別采取了PEG6000沉淀法粗提取和Sephadex G-50凝膠過(guò)濾精細(xì)提取。前者采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3因素3水平，處理后目的蛋白絕大部分都能沉淀出來(lái)，通過(guò)離心即可達(dá)到與雜蛋白分離的目的，回收率接近80％，從極差（E）分析來(lái)看，對(duì)回收率影響最大的因素為pH值和PEG6000濃度，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)蛋白的分離只能在弱酸性條件下進(jìn)行，中性及堿

5、性條件下蛋白變性為白色不溶性沉淀，PEG6000濃度為0.1g/ml時(shí)分離效果較好，較大的濃度影響沉淀與上清的分離效果，因此實(shí)驗(yàn)確定的最佳分離條件為pH6.0、NaCl0.2mol/1、PEG60000.1g/ml。由于本實(shí)驗(yàn)采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，上清中的雜蛋白少，且與目的蛋白分子量相差較大，將發(fā)酵液離心后經(jīng)過(guò)最大分辨率為30KD的Sephadex16/40凝膠柱后經(jīng)電泳鑒定達(dá)到分離的目的，回收率在60％左右，純度達(dá)到90％。