雞γ-干擾素在畢赤酵母中的表達(dá)及其生物活性檢測.pdf

1、干擾素(Interferon，IFN)是一種具有多功效的細(xì)胞因子，對(duì)多種免疫細(xì)胞具有調(diào)節(jié)作用。由于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵，且其表達(dá)產(chǎn)物的生物活性接近天然蛋白，因此本研究將利用這一系統(tǒng)來表達(dá)雞γ-干擾素（Chicken interferon gama，ChIFN-γ），為ChIFN-γ的工廠化生產(chǎn)和臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。
　　本研究將編碼ChIFN-γ成熟肽的基因克隆至畢赤酵母穿梭表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC

2、ZαA-IFN-γ。將其線性化后，采用電穿孔法轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115細(xì)胞中。挑取單菌落，先利用YPDS-ZeocinTM平板篩選出高抗性克隆，再通過MMH、MDH平板和PCR方法篩選出2株His+Mut+表型的陽性重組菌株。重組菌株用甲醇誘導(dǎo)可表達(dá)出大小約為17kD的重組ChIFN-γ(rchIFN-γ)，與天然ChIFN-γ一致;Western blotting表明，rchIFN-γ可與研制的針對(duì)ChIFN-γ的特異性多抗血清相結(jié)合

3、。
　　經(jīng)生物信息學(xué)分析，畢赤酵母表達(dá)的rchIFN-γ的等電點(diǎn)約為pH5.2，因此采用超濾濃縮、透析和DEAE陰離子交換層析來純化表達(dá)產(chǎn)物。經(jīng)SDS-PAGE鑒定，純化產(chǎn)物的純度約為70％。DF1-VSV系統(tǒng)檢測結(jié)果表明，純化后的rchIFN-γ具有較強(qiáng)的抗病毒活性，效價(jià)達(dá)10，240 IU/mL。
　　以rchIFN-γ為佐劑與H9亞型禽流感滅活疫苗聯(lián)合免疫SPF雞，研究rchIFN-γ是否對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答具有增強(qiáng)效果。

4、經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，使用rchIFN-γ試驗(yàn)雞的外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞相對(duì)百分含量以及CD4+/CD8+比值顯著高于未使用rchIFN-γ的試驗(yàn)雞(p＜0.05)。通過血凝抑制試驗(yàn)檢測疫苗免疫后試驗(yàn)雞血清中的HI抗體水平，并于免疫后35天用H9亞型禽流感病毒進(jìn)行攻擊，檢測各組雞的排毒情況。結(jié)果表明:在疫苗接種后的第14天，使用rchIFN-γ試驗(yàn)雞的HI抗體效價(jià)達(dá)到高峰，早于未使用rchIFN-γ的試驗(yàn)雞達(dá)到高峰;且使用rchIFN-