魚類來源的抗菌肽在畢赤酵母中的表達及其生物學(xué)活性.pdf

1、近年來抗生素的濫用導(dǎo)致了生物體內(nèi)菌群失調(diào)和多種耐藥性菌株的產(chǎn)生等后果，從而引發(fā)公共衛(wèi)生和食品安全等問題，因此我們急需尋找到一種新型抗菌藥物來緩解這些問題?？咕氖巧锏钟鈦聿【鷷r，在體內(nèi)迅速合成的具有免疫抗菌活性的肽類物質(zhì)?？咕倪€具有結(jié)構(gòu)和活性穩(wěn)定、不易產(chǎn)生耐藥性、體內(nèi)無藥物殘留、對環(huán)境污染小等優(yōu)點，進而受到越來越廣泛的關(guān)注。魚類生活在含有多種微生物的水域環(huán)境中，會與大量病原體頻繁接觸，具備非常發(fā)達的非特異性免疫系統(tǒng)?？咕氖囚~類非

2、特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，能夠在魚類受到損傷或病原體入侵時迅速產(chǎn)生并在體內(nèi)擴散。本文主要研究兩種魚類抗菌肽，一種是斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）和尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）來源的hepcidin，另一種是大西洋庸鰈（Hippoglossus hippoglossus L.）來源的組蛋白H2A的N端衍生物hipposin。
　　Hepcidin是由生物肝臟細胞表達的一類具有抗菌

3、作用和鐵代謝調(diào)節(jié)功能的堿性小分子肽，在機體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮了重要作用。Hepcidin在各物種間具有較高的結(jié)構(gòu)保守性，由信號肽、前導(dǎo)肽和成熟肽這三部分構(gòu)成，尤其是在成熟肽區(qū)域含有8個半胱氨酸殘基，以致在空間上可形成4個二硫鍵，這與其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和生物活性有著密切關(guān)系。Hepcidin最初從人血清中分離得到，之后在多種魚類中都有發(fā)現(xiàn)，但對于魚類hepcidin的重組表達研究還鮮有報道。
　　Hipposin是大西洋庸鰈組蛋白H2A的N端衍

4、生物，由Birkemo等從大西洋庸鰈的皮膚黏液中分離得到。Hipposin在結(jié)構(gòu)上由α螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成。它含有51個氨基酸，其中15個堿性氨基酸，無酸性氨基酸。迄今為止，關(guān)于hipposin的研究為數(shù)不多，更從未有人將其進行過重組表達。
　　本實驗主要開展了對魚類來源的抗菌肽hepcidin和hipposin在畢赤酵母中的表達、分離純化和活性檢測等研究，包括以下五個部分：
　　第一部分為基于SOE-PCR的兩種魚類hep

5、cidin成熟肽的cDNA串聯(lián)及重組表達載體的構(gòu)建。根據(jù)已有的斑點叉尾鮰hepcidin成熟肽的cDNA（mCH）及尼羅羅非魚hepcidin成熟肽的cDNA（mTH）作為模板，設(shè)計含有交叉互補序列的引物，通過SOE-PCR將mCH和mTH基因進行串聯(lián)。再以串聯(lián)片段mCH-mTH為模板，設(shè)計出含EcoR I和Not I酶切位點的引物以擴增出粘性末端。通過T4DNA連接酶將經(jīng)雙酶切處理過的mCH-mTH和表達載體pPIC9K進行連接，以構(gòu)

6、建重組表達載體pPIC9K-mCH-mTH。經(jīng)菌落PCR檢測、雙酶切鑒定及測序表明重組表達載體pPIC9K-mCH-mTH已成功構(gòu)建。
　　第二部分為mCH-mTH在畢赤酵母GS115中的表達及純化。將構(gòu)建好的pPIC9K-mCH-mTH重組質(zhì)粒用Sac I線性化后，電轉(zhuǎn)化到畢赤酵母菌GS115中。經(jīng)過不含His的MD平板，含不同濃度的G418的YPD平板以及MD、MM平板篩選，獲得His+Mut+高拷貝轉(zhuǎn)化子，提取其酵母基因組驗

7、證目的基因是否整合入酵母染色體中。篩選好的菌株在BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)，隨后轉(zhuǎn)接至BMMY培養(yǎng)基中，在30℃搖床培養(yǎng)，通過1％甲醇誘導(dǎo)表達，發(fā)現(xiàn)在72小時表達量達到最高。取72小時的發(fā)酵上清通過SP-Sepharose陽離子交換層析對目的蛋白進行分離純化。通過Folin酚法測得mCH-mTH的表達量為77mg/L。
　　第三部分為mCH-mTH的抑菌活性鑒定。發(fā)酵上清濃縮10倍后，采用瓊脂糖彌散法進行抑菌活性檢測，發(fā)現(xiàn)其對革蘭氏陽性

8、的金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性的銅綠假單胞菌具備良好的抑制效果，可以看到明顯的抑菌圈。純化后的目的蛋白 mCH-mTH通過微量肉湯稀釋法，發(fā)現(xiàn)其對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、單增李斯特菌、沙門氏菌均有較強的抑菌效果。
　　第四部分為hipposin基因的合成及其重組表達載體的構(gòu)建。根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏愛性對 hipposin基因（HIP）進行密碼子優(yōu)化，并且在5’端添加信號肽酶Kex2識別位點編碼序列，3

9、’端添加6×His標簽的編碼序列，兩端分別添加XhoI和Xba I酶切位點，經(jīng)密碼子優(yōu)化后進行人工合成。合成后的HIP與表達載體pPICZαA構(gòu)建真核重組表達載體pPICZαA-HIP，通過雙酶切檢測重組表達載體是否構(gòu)建成功，基因測序進一步驗證。構(gòu)建好的重組表達載體經(jīng)Sac I線性化后，電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X-33，通過Zeocin抗性篩選出高拷貝克隆子，并提取其酵母基因組驗證目的基因HIP已成功整合至酵母染色體中。
　　第五部分為h