雜合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及活性檢測(cè).pdf

1、目的:
　　將兩種抗菌肽優(yōu)化后的基因片段進(jìn)行拼接，通過構(gòu)建攜帶融合基因的表達(dá)載體pPICZα A-cp1-ds4并在畢赤酵母X-33中高效分泌表達(dá)，并研究雜合抗菌肽Cecropinp1-Dermaseptin S4的抗菌活性、穩(wěn)定性及抗腫瘤活性。
　　方法:
　　1.將兩種抗菌肽氨基酸序列組合在一起利用Antheprot release5.0預(yù)測(cè)雜合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4的二級(jí)結(jié)構(gòu)，

2、利用The antimicrobial peptidesdatabases(APD)預(yù)測(cè)雜合抗菌肽的理化性質(zhì)及成為抗菌肽的可能性。
　　2.抗菌肽Dermaseptin S4基因的克隆:根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏愛性和Genbank中Dermaseptin S4的氨基酸序列以及部分Cecropin P1 C-末端的部分氨基酸序列，設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)钠唇右锿ㄟ^重疊延伸PCR(SOE-PCR)進(jìn)行拼接，將拼接產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體轉(zhuǎn)化大腸

3、桿菌DH5α后測(cè)序。
　　3.雜合抗菌肽基因的克隆:分別以保存Cecropin P1和Dermaseptin S4正確序列的pPICZα A-cp1和pMD18T-ds4質(zhì)粒為模板，以各自特異性引物為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后通過SOE-PCR拼接兩基因片段，將拼接片段克隆至pMD18-T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后測(cè)序。
　　4.表達(dá)載體pPICZα-cp1-ds4的構(gòu)建:重組質(zhì)粒pMD18T-cp1-ds4和表達(dá)載體pPICZα

4、-A分別經(jīng)EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切后利用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后測(cè)序。
　　5.重組酵母菌pPICαA-cp1-ds4/X-33的構(gòu)建:將表達(dá)載體pMD18T-cp1-ds4經(jīng)SacⅠ線性化后，采用EMC830電穿孔儀低電壓模式電轉(zhuǎn)化酵母并利用100mg/L Zeocin進(jìn)行篩選。
　　6.重組子誘導(dǎo)表達(dá)及初步活性檢測(cè):采用BMGY和BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基以0.5％(v/v)甲醇濃度進(jìn)行培養(yǎng)，利用Tr

5、icine-SDS-PAGE檢測(cè)目的多肽的表達(dá)并采用瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)濃縮上清中雜合抗菌肽Cecropin P1-DermasePtin S4的抗菌活性。
　　7.表達(dá)產(chǎn)物的純化:通過提高Zeocin的濃度篩選多拷貝酵母重組子，利用BMGY和BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)并采用AKTA蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行純化。
　　8.抗菌譜及最小抑菌濃度測(cè)定:分別采用瓊脂擴(kuò)散法和微量稀釋法測(cè)定雜合抗菌肽Cecropin Pi-Dermaseptin S4

6、的抗菌譜及最小抑菌濃度。
　　9.采用Hultmark等通過計(jì)算抗菌活力來表征抗菌肽的抑菌能力的方法衡量雜合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin.S4的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性及胰酶消化穩(wěn)定性。
　　10.采用MTT法來研究雜合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4作用于小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0的效果。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)Antheprot release5.0預(yù)測(cè)雜合抗菌肽C

7、ecropin P1-Dermaseptin S4的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)雜合多肽依然能夠保持N-末端和C-末端為雙螺旋結(jié)構(gòu)，兩螺旋結(jié)構(gòu)之間存在疏松了連接片段，經(jīng)APD預(yù)測(cè)雜合抗菌肽有成為抗菌肽的可能。
　　2.經(jīng)SOE-PCR成功將拼接引物拼接成Dermaseptin S4基因，大小約120bp，將其克隆至pMD18-T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示序列與設(shè)計(jì)序列一致。
　　3.經(jīng)SOE-PCR成功將Cecropin

8、 P1和Dermaseptin S4基因片段拼接后，將其克隆至pMD18-T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示序列與設(shè)計(jì)序列一致。
　　4.pMD18T-cp1-ds4和表達(dá)載體pPICZα-A經(jīng)雙酶切、酶連反應(yīng)后，重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示開放閱讀框完全正確，所編碼的氨基酸序列與設(shè)計(jì)一致。
　　5.表達(dá)載體pPICα A-cp1-ds4經(jīng)SacⅠ線性化后在ECM830低電壓模式（電壓為

9、350 V，脈沖時(shí)間15s，脈沖次數(shù)1次）下可成功電轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33，用Zeocin篩選得到陽(yáng)性重組子。
　　6.瓊脂擴(kuò)散法初步檢測(cè)對(duì)大腸埃希菌和經(jīng)黃色葡萄球菌的作用效果，加入濃縮表達(dá)上清均有抑菌環(huán)形成。
　　7.提高Zeocin濃度篩選多拷貝重組子，結(jié)果得到的菌株對(duì)Zeocin最大的耐受濃度為400mg/L，用多拷貝重組子表達(dá)目的多肽其產(chǎn)量約為30mg/L，經(jīng)AKTA蛋白純化系統(tǒng)純化后可得一特異性蛋白條帶。
　　

10、8.抗菌譜測(cè)定實(shí)驗(yàn)中對(duì)選取的大腸桿菌DH5α、金黃色葡萄球菌、嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌、志賀氏菌SDCDC563、鼠傷寒沙門氏菌CMCC50222均有抑制作用其最小抑菌濃度分別約為37.5μ g/ml、75ug/ml、75ug/ml、150ug/ml、150ug/ml、150ug/ml，對(duì)銅綠假單孢菌27853無(wú)效。
　　9.對(duì)雜合抗菌肽進(jìn)行熱、酸堿和胰酶消化后仍能保持較高的抑菌活力。
　　10.通過MTT實(shí)驗(yàn)，雜合抗菌肽對(duì)