黑腹果蠅抗菌肽基因Metchnikowin在畢赤酵母中分泌型表達及活性檢測.pdf

1、抗菌肽是一類具有抗菌作用的免疫活性物質(zhì)，是動物非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分。他們對細菌，真菌，病原蟲以及癌細胞均表現(xiàn)出抗菌活性。近年來傳統(tǒng)抗微生物制劑的毒副作用及其耐藥菌株的出現(xiàn)，迫使人們?nèi)ふ倚滦偷目刮⑸镏苿?。Metchnikowin 基因編碼的抗菌肽具有抗革蘭氏陽性菌和真菌性能。然而由于與傳統(tǒng)抗微生物制劑抗菌機理不同，該抗菌肽不會產(chǎn)生抗藥菌株，有潛力成為新品種的抗微生物制劑，具有廣闊的應(yīng)用前景。 本實驗旨在通過基因工程的

2、手段構(gòu)建出能夠穩(wěn)定表達Metchnikowin基因的畢赤酵母真核表達系統(tǒng)，大量獲得具有生物學(xué)活性的表達產(chǎn)物，并進一步檢測利用真核系統(tǒng)中表達獲得該多肽的抗菌性，穩(wěn)定性，期望能為該抗菌肽在抗微生物制劑領(lǐng)域應(yīng)用提供理論依據(jù)。 本研究根據(jù)GeneBank中提交的序列，以果蠅總DNA模板，利用PCR技術(shù)，擴增出兩端加入了連接接頭的 Metchnikowin 基因，將接頭處理成粘性末端，以便與經(jīng)過CpoI及Not I酶切后的pHBM 905

3、B表達載體正確連接。將Metchnikowin基因與分泌型酵母表達載體pHBM 905B連接，構(gòu)建成重組酵母表達載體pHBM 905B/Metchnikowin，經(jīng)“三明治”夾心平板篩選及菌落PCR鑒定證明目的基因已整合入酵母染色體中。挑選陽性克隆菌株與100ml搖瓶中在甲醇誘導(dǎo)下大量表達，觀察表達量變化，以SDS-PAGE分析表達產(chǎn)物，用瓊脂擴散法檢測表達多肽的生物學(xué)活性，以及測試該表達多肽的熱穩(wěn)定性和PH值耐受性。實驗結(jié)果表明該表達

4、多肽相對分子量約為6.5KD，證明與糖基化后預(yù)期分子量大小一致。用瓊脂糖擴散法檢測上清液的生物學(xué)活性，觀察到明顯的抑菌圈，顯示其具有較強的抗革蘭氏陽性菌和真菌活性，并且表達產(chǎn)物有極強的熱穩(wěn)定性，同時在不同PH值環(huán)境下仍能發(fā)揮抗菌活性。結(jié)果表明該種抗菌肽能很好的在畢赤酵母表達系統(tǒng)中得到表達，并且在進一步的抗菌活性和穩(wěn)定性研究中發(fā)現(xiàn)該抗菌肽具有較強的抗菌活性，良好的熱穩(wěn)定性以及廣泛的PH值耐受性，這些特性使該抗菌肽具有非常誘人的應(yīng)用前景，并