雜合抗菌肽HMCM和TP508融合蛋白在畢赤酵母中的表達及青蒿無性繁殖技術(shù)研究.pdf

1、抗菌肽因其殺菌的高效性、廣譜性和不易產(chǎn)生耐藥性等特點受到廣泛關(guān)注，在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等相關(guān)領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。雜合抗菌肽是一類新型抗菌肽，它由來自兩種或多種抗菌肽的部分肽鏈組成，具有高效、廣譜、低毒、肽鏈較短等特點。人工設(shè)計雜合肽是研究的熱點之一，即選擇一種抗菌肽為藍本，對某些氨基酸做刪減替換或與另外一種抗菌肽的片段拼接。研究表明，一些經(jīng)過改造的抗菌肽具有與藍本相似或更高的活性，毒副作用降低，而且變短的肽鏈為降低合成成本也奠定了基礎(chǔ)。為了解

2、決抗菌肽直接提取純化困難、化學(xué)合成法成本較高、原核表達產(chǎn)物可能導(dǎo)致活性喪失并對宿主有害且難以純化等問題，選擇真核表達系統(tǒng)成為基因工程表達抗菌肽的理想選擇。
　　 因此，探索并設(shè)計新肽，改善原有抗菌肽的活性，降低或消除他們的溶血性，高效表達目的小肽對解決目前抗菌肽存在的問題都有著重要的意義和實驗價值。目前，源自不同藍本的雜合抗菌肽研究頗多，從不同方面達到或接近了預(yù)期效果;鑒于還未見四段不同類抗菌肽雜合的報道，本實驗做了一個大膽的創(chuàng)

3、新，由四段Hexapeptide(6)-Magainin(1-12)-CecropinA(1-7)-Melittin(5-12)拼接成雜合抗菌肽HMCM。
　　 為了加強雜合抗菌肽在臨床上的實用性，在保留原有活性的基礎(chǔ)上，本課題基于對活性抗菌肽構(gòu)效關(guān)系的深入研究，將凝血酶激活肽TP508融合在HMCM的合理部位以增強其在臨床應(yīng)用時對傷口的愈合作用，同時，在目的蛋白N端增加一個6×His Tag以便于蛋白的分離純化，以期為大量生產(chǎn)

4、高效雙功能抗菌肽提供有效的基因工程手段。
　　 本研究首次在畢赤酵母真核表達體系中表達了雜合抗菌肽和人凝血酶激活肽受體TP508融合蛋白，根據(jù)設(shè)計的融合蛋白氨基酸序列和畢赤酵母的密碼子偏好性，設(shè)計了六條引物經(jīng)三輪PCR獲得目的基因。將目的基因與畢赤酵母載體pPIC9K質(zhì)粒重組構(gòu)建表達質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115宿主菌，經(jīng)G418篩選得到高表達的陽性克隆，篩選鑒定為甲醇利用快型(Mut+)菌株，在搖瓶中實現(xiàn)融合蛋白的高效、穩(wěn)定和

5、分泌性表達。培養(yǎng)液上清經(jīng)超濾離心、親和層析純化到單一的目的蛋白。
　　 同時，針對青蒿的自交不親和性而引起的高青蒿素含量植株后代株系遺傳不穩(wěn)定的缺點，開展扦插生根研究，通過植物生長素促進青蒿生根，從而保持高青蒿素含量青蒿后代的遺傳穩(wěn)定，突破了青蒿素含量這一性狀不穩(wěn)定的瓶頸。
　　 青蒿素是青蒿最重要的指標，本實驗研究高青蒿素含量青蒿的繁殖方法，以提高青蒿中青蒿素的含量，探討用不同類型植物生長激素對促進青蒿的無性繁殖的影響