抗菌肽類和酶類酵母異源表達(dá)的研究.pdf

1、抗生素的過量使用和濫用導(dǎo)致大量耐藥菌的出現(xiàn)，特別是超級耐藥菌的出現(xiàn)，對人類健康造成嚴(yán)重的威脅。尋找新的更為安全高效的抗生素，以及不易產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性的抗生素替代物，對于保障人類健康，以及健康食品生產(chǎn)和動(dòng)物養(yǎng)殖具有重要意義和迫切需求。抗菌肽類物質(zhì)是天然抗菌物質(zhì)，具有穩(wěn)定性好、無毒副作用、不會(huì)出現(xiàn)細(xì)菌耐藥性等突出優(yōu)點(diǎn)，也具有替代某些抗生素的潛力。因此，本項(xiàng)研究的目的是利用基因工程的方法，構(gòu)建人工合成抗菌肽和抗菌酶基因的重組表達(dá)質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒

2、導(dǎo)入畢赤酵母或乳酸克魯維酵母中進(jìn)行異源表達(dá)，獲得了酵母表達(dá)的抗菌肽和抗菌酶，旨在為抗菌肽類物質(zhì)的實(shí)際應(yīng)用提供技術(shù)資料。本論文報(bào)道了幾種抗菌肽類物質(zhì)和具有抗菌作用的葡萄氧化酶的酵母異源表達(dá)的主要研究結(jié)果。
　　1、構(gòu)建了對革蘭氏陰性菌有很好抗性的抗菌肽AP基因重組表達(dá)載體pPICAP，將其導(dǎo)入畢赤酵母SMD1168中，獲得了抗E.coli的畢赤酵母菌株AP26，該菌株在培養(yǎng)的72 h時(shí)抑菌活性最高，之后抑菌活性降低，表明72 h時(shí)抗

3、菌肽AP的表達(dá)量最高。進(jìn)一步研究表明，在培養(yǎng)的72h后，重組菌抑菌活性降低是因?yàn)榘l(fā)生了質(zhì)粒的丟失。LC-MS結(jié)果表明重組菌株正確表達(dá)了抗菌肽AP。對菌株AP26進(jìn)行了亞硝基胍(NTG)誘變，篩選到了抗菌肽AP表達(dá)量最高的誘變菌株APmu4，其抗菌肽AP最高生物效價(jià)達(dá)到1.7×109 U/L。對影響抗菌肽AP表達(dá)量的因素進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)pH為7.5、接種量為50g/L、鹽濃度較高的YDFMY培養(yǎng)基、酵母提取物能夠提高抗菌肽AP的表達(dá)量。<

4、br>　　2、構(gòu)建了具有廣譜抗菌活性的抗菌肽AB基因的重組載體pPICAB，將其導(dǎo)入到畢赤酵母SMD1168菌株中，獲得分泌表達(dá)抗菌肽AB的畢赤酵母菌株，該重組菌株對E.coti有抗性，LC-MS結(jié)果表明該菌株正確表達(dá)了抗菌肽AB。對重組菌株進(jìn)行了NTG誘變，篩選到超量表達(dá)抗菌肽AB的誘變菌株ABN97。為了進(jìn)一步提高誘變菌株抗菌肽AB表達(dá)量，構(gòu)建了顫藻血紅蛋白基因vgb的重組載體，將其導(dǎo)入到菌株ABN97中，篩選出了抑菌效果最好的菌株

5、ABN97vgb，抗菌肽AB生物效價(jià)達(dá)到4.53×108 U/L。對影響抗菌肽AB表達(dá)量的因素進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)pH為6.0、接種量為50 g/L、鹽濃度較高的YDFMY培養(yǎng)基、酵母提取物能夠提高抗菌肽AB的表達(dá)量，最高表達(dá)量提高了14倍。
　　3、構(gòu)建了對革蘭氏陽性菌有良好抑菌活性的抗菌肽菌絲霉素Plectasin基因重組質(zhì)粒pPICPle，將其導(dǎo)入畢赤酵母并成功異源表達(dá)抗菌肽Plectasin。對重組菌株進(jìn)行NTG誘變并篩選得到

6、高效表達(dá)Plectasin的誘變菌株P(guān)le100，其Plectasin的表達(dá)量提高了1.93倍。對影響菌株P(guān)le100 Plectasin表達(dá)量的因素進(jìn)行研究，結(jié)果表明鹽濃度較高的YDFMY培養(yǎng)基和酵母提取物能提高菌株P(guān)lectasin表達(dá)量。
　　4、構(gòu)建了抗菌肽PSI基因的整合型載體pLACPSI和游離型載體pKDUPSI，將其導(dǎo)入到乳酸克魯維酵母K1SEL1基因突變型菌株中，篩選到分泌表達(dá)抗菌肽PSI的重組菌株。對重組菌株發(fā)

7、酵液中抗菌肽PSI進(jìn)行硫酸銨沉淀法和陽離子交換柱純化，SDS-PAGE檢測驗(yàn)證了抗菌肽PSI。對重組菌株產(chǎn)抗菌肽PSI的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明中性或偏堿性、酵母提取物和鹽度較高的YDFMY培養(yǎng)基更有利于抗菌肽PSI的表達(dá)。純化的抗菌肽PSI對大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）、三線鐮刀菌（Fusarfum tricinctum）、鏈格孢菌(Alternaria alternata)、灰霉菌（Botrytis ci

8、nerea）、平頭炭疽（Colletotrichumtruncatum）有抗性。水果保鮮實(shí)驗(yàn)表明純化后的抗菌肽PSI也具有開發(fā)為新型果蔬保鮮劑的潛力。
　　5、構(gòu)建了葡萄糖氧化酶(GOX)基因的整合型載體pLACGOX和游離型載體pKDUGOX，成功將其導(dǎo)入到乳酸克魯維酵母K1SEL1基因突變型菌株中，獲得了一株能超量分泌表達(dá)GOX的乳酸克魯維酵母菌株，其GOX最大表達(dá)量為70±7 kU/L，SDS-PAGE檢測驗(yàn)證了GOX正確表