抗菌肽高效表達(dá)策略及活性研究.pdf

1、利用基因工程手段生產(chǎn)抗菌肽的過程中，由于抗菌肽對(duì)宿主細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生毒性使得蛋白表達(dá)受到影響，而改變?nèi)诤项^是使抗菌肽高效表達(dá)策略之一。本實(shí)驗(yàn)利用實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功構(gòu)建并保存的工程菌，分析其誘導(dǎo)后OD600的變化以及不同融合頭對(duì)G13毒性的影響。實(shí)驗(yàn)對(duì)pET28a-G13進(jìn)行突變，以改變G13的N端融合頭凈正電荷數(shù)。設(shè)計(jì)突變引物，以質(zhì)粒pET28a-G13為模板，PCR擴(kuò)增序列，構(gòu)建突變體pET28a′-G13，并進(jìn)行誘導(dǎo)。對(duì)共表達(dá)工程菌在不同的抗

2、生素比例下進(jìn)行誘導(dǎo)，Tricine-SDS-PAGE電泳檢測(cè)，比較分析抗生素比例對(duì)蛋白表達(dá)的影響，同時(shí)比較抗生素比例不同質(zhì)粒的拷貝數(shù)的變化。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)融合頭對(duì)G13毒性抑制效果與其凈負(fù)電荷數(shù)及其氨基酸分布有關(guān)。
　　 此外，針對(duì)本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)摸索出的重組G13結(jié)構(gòu)域的表達(dá)的方法進(jìn)行改良，通過改變?nèi)芙獾鞍椎淖冃詣约案淖兤錆舛鹊确椒?，希望能夠減少尿素對(duì)重組肽的修飾。而且，在對(duì)純化得到的G13進(jìn)行了初步的檢測(cè)之后，對(duì)于G13的活性研究

3、進(jìn)行了擴(kuò)展，進(jìn)一步研究G13結(jié)構(gòu)域的溶血活性作用并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 另外本實(shí)驗(yàn)對(duì)抗菌肽vgf-1的表達(dá)和活性進(jìn)行了初步研究。通過對(duì)NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的檢索查詢找到了一個(gè)從眼鏡蛇蛇毒中提取的具有抗結(jié)核桿菌效用的小肽Vgf-1。根據(jù)Vgf-1氨基酸序列和大腸桿菌的密碼子偏好性，得出Vgf-1的基因序列。設(shè)計(jì)采用重疊PCR的方法得到基因序列。分三步擴(kuò)增Vgf-1的基因片段(A,B,C)，這三個(gè)片段經(jīng)過膠回收后分別均與表達(dá)載

4、體pBAD/TOPO連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli TOP 10，經(jīng)過測(cè)序鑒定，分別命名為 pBAD-Vgf-1-A,B,C。用阿拉伯糖誘導(dǎo)4h，經(jīng)超聲破碎處理后，SDS-PAGE電泳檢測(cè)，融合蛋白的位置正確，且可以看出大多數(shù)目的蛋白以包涵體的形式存在。用Bradford方法測(cè)菌體總蛋白量，用Bandscan 軟件分析融合蛋白的表達(dá)量分別約占總體蛋白量的58.3％、48.7％和45.5％，因此推算出推算每升工程菌發(fā)酵液產(chǎn)生的包涵體約為