海馬抗菌肽HKABF的重組表達(dá)純化及初步活性研究.pdf

1、抗菌肽作為天然免疫系統(tǒng)中一個重要成員在清除病原體感染時發(fā)揮著重要作用。本實(shí)驗(yàn)室在構(gòu)建大海馬雄性孵化袋c(diǎn)DNA文庫時發(fā)現(xiàn)的一種抗菌肽基因編碼的蛋白，通過序列比對發(fā)現(xiàn)與來自豬蛔蟲假體腔的ASABF抗菌肽有一定的序列相似性(45％)，而命名為HKABF。我們嘗試用基因工程蛋白重組的方法獲得較多量的目的蛋白，以證實(shí)這一抗菌肽的功能并為以后的深入研究做準(zhǔn)備。 在實(shí)驗(yàn)室前期工作中，通過用pTRX載體融合表達(dá)的方法在大腸桿菌E.coliBL2

2、1(DE3)中表達(dá)，但最終沒有獲得有活性的目的蛋白。另外也嘗試用酵母直接進(jìn)行分泌表達(dá)，雖然結(jié)果顯示此蛋白是有抗菌活性的，但是發(fā)生了基因沉默現(xiàn)象，導(dǎo)致篩選出的表達(dá)菌株不能穩(wěn)定遺傳。這可能與目的蛋白對宿主本身的毒害作用有關(guān)。本研究主要是通過在原海馬抗菌肽的成熟肽N端融合一段前體肽中富含酸性氨基酸的pro-region序列，這段酸性肽能夠中和海馬抗菌肽成熟肽的強(qiáng)堿性而減弱其對宿主本身的毒害作用，然后在畢赤酵母中以融合蛋白的形式分泌表達(dá)。通過這

3、種方式，融合蛋白能夠在酵母中高效表達(dá)并且由于在設(shè)計(jì)目的蛋白表達(dá)基因時加入了6His標(biāo)簽而可以直接用Ni2+柱對融合蛋白進(jìn)行純化。獲得的融合蛋白沒有抗菌活性但是當(dāng)用Enterokinase蛋白酶酶切后就具有明顯的抗菌活性。 通過純化我們最終獲得了15mg/L的目的蛋白HKABF，利用這些蛋白我們對這一抗菌肽作了一些理化性質(zhì)研究。包括抗菌活性，熱穩(wěn)定性，酸堿穩(wěn)定性，鹽濃度對活性的影響，溶血性，色譜純度鑒定以及二級結(jié)構(gòu)的測定等。結(jié)果表

4、明重組HKABF能夠在比較低的濃度下就能抑制金黃色葡萄球菌和白葡萄球菌的生長，MIC分別為0.5mg/ml和2.5mg/ml。重組HKABF有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性，溶血性很低，其活性不受NaCl和KCl高鹽濃度的影響，但是其在僅15mM的CaCl2鹽濃度下活性就完全受到抑制。利用反向高效液相色譜鑒定純化的重組HKABF，其色譜純度達(dá)85％以上。圓二色譜測定其二級結(jié)構(gòu)可以將其歸為CSaβ型抗菌肽。 以上結(jié)果可以說明通過將酸性