組蛋白H2A衍生抗菌肽的重組表達(dá)及活性分析.pdf

1、目前，由于食品生產(chǎn)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域中抗生素的廣泛使用，造成病原菌耐藥性的提高以及抗生素殘留等諸多危及人類健康的問題。因此，目前人們急需尋找一種高效、廣譜、安全的新型抗菌劑替代傳統(tǒng)抗生素。由于抗菌肽獨(dú)特的抗菌機(jī)制，不易使病原菌產(chǎn)生耐藥性，具有廣譜的抗菌活性等優(yōu)點(diǎn)，它在治療學(xué)領(lǐng)域，畜牧業(yè)，食品防腐劑等已被用來作為新一代的抗微生物劑。已報(bào)道的抗菌肽超過2000種，這些抗菌肽攜帶凈正電荷并且大多數(shù)傾向于形成兩親的α-螺旋結(jié)構(gòu)。

2、　　 組蛋白衍生的抗菌肽(histone-derivedantimicrobialpeptides，)是組蛋白在某種機(jī)制作用下被降解、修飾和分泌出的一種小分子多肽。基于HDAPs具有體外抗菌活性，本研究在對四膜蟲及人類組蛋白H2A分析的基礎(chǔ)上，通過基因工程技術(shù)，構(gòu)建四膜蟲及人類組蛋白H2A衍生的抗菌肽的高效融合表達(dá)載體，在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)四膜蟲組蛋白H2A衍生抗菌肽(Tetrahymenathermophilahistone-

3、derivedantimicrobialpeptides，ThAP)和人類蛋白H2A衍生抗菌肽(Humanhistone-derivedantimicrobialpeptides，HhAP)的重組表達(dá)，對重組蛋白的抑菌活性進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 (1)ThAP和HhAP基因的設(shè)計(jì)合成根據(jù)四膜蟲及人類組蛋白H2A序列，設(shè)計(jì)H2A衍生的HDAPs:ThAP和HhAP肽序列，利用大腸桿菌偏愛密碼子表，合成在大腸桿菌中高效表達(dá)的

4、組蛋白衍生物抗菌肽基因片段ThAP和HhAP，并構(gòu)建于克隆載體pUC57上。
　　 (2)ThAP和HhAP生物信息學(xué)分析通過抗菌肽數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站及SOPMA程序在線分析了ThAP和HhAP氨基酸殘基的分子量大小、凈電荷數(shù)、兩親性、等電點(diǎn)、二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)等，預(yù)測結(jié)果顯示:ThAP和HhAP蛋白質(zhì)分子量分別為2.15KD、2.22KD;ThAP主要由α螺旋結(jié)構(gòu)組成，占57.89％，HhAP主要由α螺旋(43％)和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)(38

5、％)組成。
　　 (3)重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及GST-ThAP和GST-HhAP的表達(dá)及純化將重組質(zhì)粒pUC57-ThAP和pUC57-HhAP用BamHⅠ和XholⅠ雙酶切，目的基因與表達(dá)載體pGEX-4T-1連接，獲得pGEX-4T-1-ThAP和pGEX-4T-1-HhAP重組表達(dá)質(zhì)粒。重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21株中，獲得重組工程菌株BL21/pGEX-4T-1-ThAP和BL21/pGEX-4T-1-HhAP。0.

6、1mMIPTG,37℃誘導(dǎo)4h,GST-ThAP和GST-HhAP表達(dá)，GST瓊脂糖親合層析柱分離純化得到融合蛋白GST-ThAP和GST-HhAP。
　　 (4)GST-ThAP和GST-HhAP活性檢測GST-ThAP(ThAP)/GST-HhAP對革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌(DH5α)和革蘭氏陽性細(xì)菌金黃色葡萄球菌的抑菌活性結(jié)果顯示:融合蛋白GST-ThAP和GST-HhAP對G+和G-細(xì)菌均有抑制作用，融合蛋白GST-ThA

7、P比GST-HhAP對DH5α抑制作用明顯;GST-HhAP比GST-ThAP對金黃色葡萄球菌抑菌活性強(qiáng)。劃痕擦傷遷移實(shí)驗(yàn)檢測GST-ThAP/GST-HhAP/ThAP蛋白對C6細(xì)胞遷移的影響，結(jié)果表明，培養(yǎng)8h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對照組遷移速度基本相同;培養(yǎng)20h時(shí)，遷移率大小為:Tris＞GST-ThAP(5uL)＞GST-ThAP(15uL)＞ThAP(5uL)，GST-ThAP和GST-HhAP顯著抑制C6細(xì)胞遷移。
　　 綜