暹羅鱷(Crocodylus siamensis)抗菌活性物質(zhì)的篩選及抗菌肽hepcidin基因的克隆表達(dá).pdf

1、鱷魚是一類古老的爬行動物，在物種進化中占據(jù)重要的地位，其抗菌肽等免疫相關(guān)因子的研究相對較少。本論文在認(rèn)真分析國內(nèi)外有關(guān)報道的基礎(chǔ)上，以人工養(yǎng)殖的暹羅鱷為對象，以探尋新的抗菌肽為目標(biāo)，應(yīng)用蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)、基因克隆及體外表達(dá)技術(shù)、結(jié)合生物信息學(xué)軟件分析，主要取得了以下研究結(jié)果：
　　 (1)全面研究了暹羅鱷不同組織粗提物的抗菌活性，發(fā)現(xiàn)血液、肝臟和卵巢提取物對金黃色葡萄球菌的抗菌活性最強。暹羅鱷的新鮮血清可以抑制革蘭氏陽性菌和革

2、蘭氏陰性菌的生長，56℃滅活30 min后活性降低或喪失。用乙酸提取法制備的暹羅鱷白細(xì)胞粗提物對金黃色葡萄球菌和尖孢鐮刀菌具有明顯的抗菌活性。掃描電鏡結(jié)果顯示，粗提物處理30 min后，金黃色葡萄球菌菌體表面變得粗糙，有明顯的顆粒狀附著物，細(xì)胞壁有內(nèi)陷；處理60 min后，細(xì)胞嚴(yán)重萎縮、變形，附有大量膠塊狀物質(zhì)。處理后的尖孢鐮刀菌孢子形態(tài)由表面光滑的鐮刀狀變成了表面附有大量乳突狀物質(zhì)的球形。
　　 (2)通過蛋白質(zhì)層析技術(shù)結(jié)合非

3、變性酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(AU-PAGE)純化了白細(xì)胞粗提物中的一種抗菌活性物質(zhì)，經(jīng)過Shotgun串聯(lián)質(zhì)譜分析，推測該活性物質(zhì)是組蛋白H1樣的蛋白或肽段，并將其命名為Cshistidin。
　　 (3)克隆了暹羅鱷hepcidin cDNA，其ORF編碼一個99-aa的前肽原preprohepcidin。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明：暹羅鱷preprohepcidin包含一個25-aa的信號肽，一個48-aa的prodomain和

4、一個26-aa的成熟肽(命名為Cs-hepc)。Cs-hepc的分子量為2933.46 Da，理論等電點為8.53，構(gòu)建的Cs-hepc三維結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)一個典型的β-sheet構(gòu)象。分別從DNA水平和蛋白質(zhì)水平上對暹羅鱷preprohepcidin進行了同源比對，構(gòu)建了preprohepcidin的系統(tǒng)進化樹，結(jié)果表明：相對于兩棲類和魚類，暹羅鱷preprohepcidin與哺乳類的親緣關(guān)系更近。
　　 (4)運用Real-time

5、 PCR研究了暹羅鱷hepcidin在健康鱷魚中的組織表達(dá)，結(jié)果表明：暹羅鱷hepcidin在肝臟、肌肉、心臟、腎臟、小腸、血液、脂肪、脾臟、性腺和肺中均有表達(dá)。其中肝臟表達(dá)量最高，其次是肌肉和心臟，肝臟表達(dá)量是肌肉表達(dá)量的八十多倍，是心臟表達(dá)量的三百多倍。腎臟中的表達(dá)量最低。
　　 (5)構(gòu)建了暹羅鱷hepcidin基因的原核重組表達(dá)質(zhì)粒pET-hepc。在E.coli表達(dá)系統(tǒng)中成功的誘導(dǎo)表達(dá)了融合蛋白Trx-hepc。用腸激

6、酶酶切后，獲得了與預(yù)期大小一致的目的產(chǎn)物，但是沒有檢測到明顯的抗菌活性。
　　 (6)合成了完全為酵母偏愛密碼子的編碼暹羅鱷hepcidin的基因Cs-hepc-pp，成功構(gòu)建了暹羅鱷hepcidin基因的三種真核表達(dá)重組質(zhì)粒，分別用于表達(dá)單一的暹羅鱷hepcidin成熟肽Cshepc、帶有組氨酸標(biāo)簽的Cshepc/6His、帶有組氨酸標(biāo)簽和分子伴侶c-cmyc的融合蛋白Cshepc/c-cmyc+6His。用甲醇誘導(dǎo)的方法在畢

7、赤酵母KM71中實現(xiàn)了目的產(chǎn)物的高效表達(dá)?；钚苑治霰砻鳎喝N表達(dá)上清對四株細(xì)菌均有明顯的抑菌效果，其中Cshepc的活性最強，Cshepc/6His次之，Cshepc/c-cmyc+6His最弱。表達(dá)產(chǎn)物對芽孢枯草桿菌(Bacillussubtilis)的抑菌活性最強，50μg/ml的Cshepc可以抑制85.7％的B.subtilis的生長，對水產(chǎn)病原菌溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)的活性較弱。用鎳柱親和層析法從表達(dá)