鋸緣青蟹陰離子抗菌肽SCY2基因克隆、表達特性及其抗菌活性的研究.pdf

1、本研究根據(jù)實驗室獲得的SCY2部分cDNA序列，設(shè)計特異性引物，以雄性鋸緣青蟹的性腺組織RNA為模板，利用RT—PCR及5’，3’-RACE等方法，克隆獲得了抗菌肽SCY2的全長cDNA序列947bp，編碼100個氨基酸，預(yù)測分子量約為10925.4Da，等電點PI為4.84，與已發(fā)表的鋸緣青蟹抗菌肽Scygonadin基因的氨基酸序列相似性為65.08％，因而認(rèn)為SCY2是在鋸緣青蟹中發(fā)現(xiàn)的又一個新的陰離子抗菌肽。主要結(jié)果如下：

2、 采用PCR及反向PCR等方法，對基因組DNA及其側(cè)翼序列進行擴增，獲得了SCY2基因組DNA的全長序列，該基因組全長為2607bp，包含3個外顯子和2個內(nèi)含子。與Scygonadin具有相似的基因結(jié)構(gòu)組成；獲得了SCY2基因的上下游側(cè)翼序列，5’上游序列含有轉(zhuǎn)錄起始位點以及TATA box等啟動子所具有的特征序列。 用RT-PCR和Northern-blot等方法，分別檢測了SCY2基因在鋸緣青蟹(雄性和雌性)不同組織器官(

3、鰓、甲殼、眼、血細胞、肝胰臟、心臟、肌肉、甲殼下皮層、胃和生殖系統(tǒng)等)中的轉(zhuǎn)錄表達情況，發(fā)現(xiàn)該基因僅在雄性生殖系統(tǒng)中表達。該表達特性與Scygonadin相似。檢測細菌感染條件下鋸緣青蟹各組織SCY2及Scygonadin表達情況，發(fā)現(xiàn)在感染后48 h內(nèi)，SCY2和Scygonadin mRNA在性腺組織中的表達水平均無明顯變化，說明外部細菌感染不是SCY2的直接誘導(dǎo)表達因素。 為確定SCY2的抗菌功能，根據(jù)SCY2編碼序列，構(gòu)

4、建了pTrc-CKS/SCY2融合基因表達載體。將表達載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，以IPTG誘導(dǎo)表達，表達產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，通過變性復(fù)性后獲得融合蛋白SCY2-CKS。利用金屬鏊合層析純化獲得SCY2融合蛋白，并以3C蛋白酶酶切獲得重組表達的SCY2。用0.4mg/ml重組SCY2在11種海洋動物病原菌和耐藥性細菌進行抗菌活性檢測(細菌殺傷指數(shù)(KI))，結(jié)果顯示：SCY2能夠選擇性的抑制革蘭氏陰性菌和陽性菌的生長，對水產(chǎn)動物病原菌嗜