擬穴青蟹抗菌肽Scygonadin及聯(lián)合多肽Scy-hepc的表達和抗菌、抗病毒功能研究.pdf

1、抗菌肽(antimicrobial peptide)是先天性免疫的重要組分,廣泛存在于生物界的各個門類,進化上相對保守,具有廣譜的抗菌、抗病毒和抗腫瘤等作用?？咕木哂锌梢姷膽们熬?但直接從動物體提取抗菌肽不適于未來產(chǎn)業(yè)化的要求。本研究利用本實驗室分離鑒定的擬穴青蟹抗菌肽Scygonadin基因和大黃魚抗菌肽Hepcidin基因,通過基因工程技術構建了Soygonadin基因及與大黃魚抗菌肽Hepcidin基因聯(lián)合的基因工程穩(wěn)定表達菌

2、株,優(yōu)化其表達與純化工藝,研究其基因表達產(chǎn)物的抗菌與抗病毒活性、抗菌機制以及抗菌(毒)譜,為未來抗菌肽的產(chǎn)業(yè)化提供技術支撐；同時利用基因表達產(chǎn)物制備Scygonadin的抗體,闡明了Scygonadin蛋白在雄性擬穴青蟹的組織表達定位,為Scygonadin目標性應用以及其功能的深入研究奠定基礎。主要研究結果如下:
　　 1.Scygonadin基因在大腸桿菌中的表達及其抗菌活性:構建了Scygonadin基因的兩種融合表達載體

3、pTrc-CKS/scygonadin和pET28-scygonadin,融合蛋白CKS-scygonadin主要以可溶性形式表達,分子量為43kDa,經(jīng)3C蛋白酶酶切,兩次親和純化后,獲得了11kDa的目的蛋白Seygonadin,產(chǎn)量為10.6mg/L。以pET28a為載體表達的Scygonadin主要以可溶性形式表達,經(jīng)一次親和純化后即獲得目的蛋白,產(chǎn)量為65.9mg/L。體外抗菌實驗結果顯示,上述兩種原核表達的scygonadi

4、n抗菌譜相似,能選擇性地抑制革蘭氏陽性和陰性菌,在所測濃度下對酵母和真菌無抗性(>60μM)；30μM的Scygonadin能在較短時間內(nèi)(30分鐘)殺滅全部的金黃色葡萄球菌。比較發(fā)現(xiàn),pET28-scygonadin是一個較理想的原核表達載體。
　　 2.Scygonadin基因在畢赤酵母中的表達及其抗菌活性:體外構建了Scygonadin基因的真核表達載體pPIC9K—scygonadin,轉化畢赤酵母GS115,甲醇誘導后

5、在培養(yǎng)上清中檢測到目的蛋白Scygonadin。并用親和層析純化表達產(chǎn)物,產(chǎn)量為20mg/L。與原核表達產(chǎn)物Scygonadin比較,真核表達的Scygonadin具有較強的抗菌活性。
　　 3.Scygonadin蛋白在雄性擬穴青蟹的組織定位:利用pET28-scygonadin表達純化的Scygonadin蛋白免疫Balb/c小鼠,制備Scygonadin抗體。利用Scygonadin抗體,通過SDS-PAGE、Wester

6、n—blot和質(zhì)譜分析檢測了成熟雄性擬穴青蟹各組織的表達情況,發(fā)現(xiàn)與其基因的表達相對應,Scygonadin蛋白在射精管中高表達,且顯著高于其它組織。
　　 4.聯(lián)合多肽Scy-hepc在大腸桿菌中的表達、抗菌活性和抗菌機理:根據(jù)Scygonadin和Hepcidin基因的cDNA序列,將兩基因進行合理拼接,構建了聯(lián)合多肽原核表達載體pET28-scy/hepc,在大腸桿菌BL21(DE3)plysS菌株中誘導表達,獲得24kD

7、a的融合蛋白。利用pET28-scy/hepc表達載體的C端6×His-Tag,通過親和層析純化聯(lián)合多肽Scy-hepc,產(chǎn)量為60mg/L。聯(lián)合表達產(chǎn)物Scy—hepc具有較強的抑菌和殺菌能力,顯著高于原核表達產(chǎn)物Scygonadin。Scy-hepc(12.5μM,MBC)可在30分鐘殺滅90％以上的金黃色葡萄球菌,在1.5-2小時殺滅90％以上的施氏假單胞菌:Scy-hepc(50μM,MBC)對藤黃微球菌具有相對緩慢的殺菌過程,

8、在4小時可殺死90％以上的藤黃微球菌。將原核表達的聯(lián)合Scy-hepc與施氏假單胞菌孵育2小時后,通過掃描電鏡觀察到施氏假單胞菌表面結構崎嶇不平,有泡狀隆起,大量細菌可見內(nèi)容物外泄。
　　 5.聯(lián)合多肽Scy-hepc在畢赤酵母中的表達、抗菌活性:通過優(yōu)化密碼子,構建了三種Scygonadin和Hepcidin的真核串聯(lián)表達載體,分別為pPIC9K—scy/hepc、pPIC9K-scy/hepc(6CAC)和pPIC9K-sc

9、y/hepc(6CAT),其中pPIC9K-scy/hepc轉化畢赤酵母GS115后獲得較高表達量。通過培養(yǎng)條件優(yōu)化,Scy-hepc在培養(yǎng)基初始值為pH6.0,甲醇濃度為0.75％條件下,誘導表達36小時,可獲得最高表達量,約為23mg/L。真核表達產(chǎn)物Scy-hepc具有廣譜的抗菌活性,與原核表達產(chǎn)物Scy-hepc比較,真核表達的Sey-hepc抗菌活性更強,對水產(chǎn)致病菌如嗜水氣單胞菌和熒光假單胞菌的抑殺菌活性(MIC1.6-3.

10、2μM)顯著高于原核表達產(chǎn)物Scy-hepc(MIC25-50μM)。
　　 6.重組表達的Scygonadin和Scy-hepc成熟肽的抗病毒活性:體外制備紅螯螯蝦的造血組織干細胞(Hpt),分別用真核表達產(chǎn)物Scygonadin、Scy—hepc和化學合成的Hepcidin成熟肽,以不同的方式作用于對蝦白斑病毒(WSSV),通過檢測病毒復制的極早期基因IE1的表達情況判斷三種受試抗菌肽的抗病毒效果。實驗結果顯示:真核表達產(chǎn)物