蝦夷馬糞海膽抗菌肽的功能研究.pdf

1、抗菌肽（antibacterial peptides）是一類(lèi)普遍存在于真核生物體內(nèi)，抗菌譜廣泛，不易產(chǎn)生耐藥性的小分子多肽，對(duì)生物體的免疫具有調(diào)控作用，是天然免疫的重要組成成分，其作為傳統(tǒng)抗生素的替代品，具有較高的研發(fā)價(jià)值。以往對(duì)抗菌肽的研究多集中于哺乳動(dòng)物，對(duì)只具有天然免疫的無(wú)脊椎動(dòng)物的抗菌肽研究則較少，本研究以蝦夷馬糞海膽為研究對(duì)象，展開(kāi)如下研究：首先從實(shí)驗(yàn)室已有的蝦夷馬糞海膽（Strongylocentrotus intermed

2、ius）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出了抗菌肽基因SiStrongylocin1和SiStrongylocin2的部分片段，用RACE技術(shù)擴(kuò)增獲得SiStrongylocin1和SiStrongylocin2的CDS并借助多種生物信息學(xué)軟件分析其基本序列特征；進(jìn)一步以獲得的抗菌肽基因?yàn)槟０暹M(jìn)行RT-qPCR，分析SiStrongylocin1和SiStrongylocin2兩種抗菌肽在蝦夷馬糞海膽不同組織（體腔液、腸、圍口、管足、性腺）和不同發(fā)育期

3、（受精卵、八細(xì)胞、囊胚、原腸、棱柱、兩腕、四腕）的表達(dá)情況，并對(duì)抗菌肽基因的表達(dá)情況進(jìn)行比較和探討；最后，選用pGEX-4T-1為表達(dá)載體，通過(guò)雙酶切法構(gòu)建重組子pGEX-4T-1-SiStrongylocin1和pGEX-4T-1-SiStrongylocin2并將重組子轉(zhuǎn)入BL21(DE3) pLysS和Transseta兩種表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞中，以IPTG做誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，對(duì)其表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化以獲得產(chǎn)量較高的重組蛋白，選用96

4、孔板微量二倍稀釋法對(duì)重組抗菌肽抑菌效果進(jìn)行檢測(cè)，分析其抑菌活性。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：SiStrongylocin1編碼區(qū)為252bp，編碼83個(gè)氨基酸，SiStrongylocin2編碼區(qū)為249bp,編碼82個(gè)氨基酸，編碼區(qū)均由信號(hào)肽、前序列和成熟肽三部分組成，氨基酸序列中均含有6個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基，經(jīng)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn) SiStrongylocin1含三個(gè)α螺旋，SiStrongylocin2含2有兩個(gè)簡(jiǎn)單的α螺旋和一個(gè)β折疊，在

5、進(jìn)化上蝦夷馬糞海膽的抗菌肽與綠海膽(Strongylocentrotus droebachiensis)和紫海膽(Strongylocentrotus purpuratus)的抗菌肽相近；抗菌肽在不同組織和不同發(fā)育期均有表達(dá)，在不同組織中 SiStrongylocin1和SiStrongylocin2分別在腸道和體腔液中表達(dá)量最高，在不同發(fā)育期，SiStrongylocin1和SiStrongylocin2均在囊胚期表達(dá)量最高；通過(guò)SD

6、S-PAGE凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)重組蛋白以包涵體形式表達(dá)，以IPTG為誘導(dǎo)劑的最佳表達(dá)條件為28℃，200rpm，IPTG1mM，誘導(dǎo)8h；對(duì)獲得的重組蛋白進(jìn)行抑菌活性驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)SiStrongylocin2對(duì)兩種菌的抑制效果比SiStrongylocin1更顯著，且兩種重組抗菌肽對(duì)大腸桿菌的抑制效果比強(qiáng)壯弧菌更顯著。
　　綜上所述，本研究獲得了蝦夷馬糞海膽兩個(gè)抗菌肽基因并發(fā)現(xiàn)其具有抗菌肽的一般特征，驗(yàn)證了抗菌肽基因的表達(dá)水平與不同組織