雞AvBD6成熟肽在畢赤酵母中的表達及其抗菌活性分析.pdf

1、雞β-防御素(Avian beta-defensin)是一種半胱氨酸含量多的小分子多肽，由于其具有特殊的抗菌機理，可能替代抗生素且實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
　　本實驗運用基因工程等技術(shù)，研究雞β-防御素-6(AvBD6)的功能。使用以3-磷酸甘油醛脫氫酶為啟動子的組成型表達載體pGHKα，在畢赤酵母中構(gòu)建出雞AvBD6的組成型表達系統(tǒng)，并成功獲得重組AvBD6蛋白，并通過抑菌試驗等方式檢測表達蛋白的抗菌活性，內(nèi)容與結(jié)果所述如下:
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2、 AvBD6載體的構(gòu)建
　　通過NCBI中AvBD6的cDNA編碼區(qū)序列（登錄號:NM_001001193），參考畢赤酵母密碼子的偏愛性，在AvBD6成熟肽基因的5'端添加EcoRⅠ酶切位點和6個組氨酸序列，在基因的3'端添加TAA位點和NotⅠ酶切位點，設(shè)計并合成出pUC57-AvBD6基因序列。將pUC57-AvBD6通過EcoRⅠ與NotⅠ雙酶切，回收目的片段并且連接，構(gòu)建出重組pGHKα-AvBD6質(zhì)粒;同理對pGHKα載

3、體進行雙酶切。經(jīng)過SacⅠ和BglⅡ依次酶切pGHKα-AvBD6，使其線性化，用以去除Amp抗性基因。將線性化后的片段電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115中，將得到的陽性轉(zhuǎn)化子通過PCR鑒定，再通過雙酶切以及測序鑒定。
　　2重組AvBD6的組成型表達
　　挑取pGHKα和pGHKα-AvBD6鑒定正確的陽性轉(zhuǎn)化子，分別接種至5mL的YPD培養(yǎng)液中，于28℃200r/min恒溫振蕩培養(yǎng)到對數(shù)期。將對數(shù)期的培養(yǎng)物以1％的比例轉(zhuǎn)接至50

4、mL發(fā)酵培養(yǎng)基瓶中培養(yǎng)48h。并經(jīng)4℃、12000g離心10min，收集上清液，即獲得重組AvBD6蛋白。通過Tricine-SDS-PAGE分析表達后的上清，差異條帶顯現(xiàn)在6kDa左右處。
　　3重組AvBD6體外抑菌活性研究
　　通過瓊脂孔穴擴散抑菌法，用已表達的上清濃縮液進行抗微生物活性分析，以檢測重組蛋白的體外抑菌能力，分析表明AvBD6蛋白對糞腸球菌(Enterococcus faecalis ATCC29212)

5、、大腸桿菌(Escherichia coli CMCC44102)、綠膿假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC27853）、甲型副傷寒沙門氏菌(Salmonella paratyphi ATCC9150)、巴氏桿菌(Pasteurella)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC25923)均有抑菌活性。
　　本研究是以組成型表達載體pGHKa為基礎(chǔ)，構(gòu)建重組AvBD6畢赤酵