雞AvBD6成熟肽在畢赤酵母中的表達(dá)及其抗菌活性分析.pdf

1、雞β-防御素(Avian beta-defensin)是一種半胱氨酸含量多的小分子多肽，由于其具有特殊的抗菌機(jī)理，可能替代抗生素且實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
　　本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用基因工程等技術(shù)，研究雞β-防御素-6(AvBD6)的功能。使用以3-磷酸甘油醛脫氫酶為啟動(dòng)子的組成型表達(dá)載體pGHKα，在畢赤酵母中構(gòu)建出雞AvBD6的組成型表達(dá)系統(tǒng)，并成功獲得重組AvBD6蛋白，并通過(guò)抑菌試驗(yàn)等方式檢測(cè)表達(dá)蛋白的抗菌活性，內(nèi)容與結(jié)果所述如下:
　　1

2、 AvBD6載體的構(gòu)建
　　通過(guò)NCBI中AvBD6的cDNA編碼區(qū)序列（登錄號(hào):NM_001001193），參考畢赤酵母密碼子的偏愛性，在AvBD6成熟肽基因的5'端添加EcoRⅠ酶切位點(diǎn)和6個(gè)組氨酸序列，在基因的3'端添加TAA位點(diǎn)和NotⅠ酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成出pUC57-AvBD6基因序列。將pUC57-AvBD6通過(guò)EcoRⅠ與NotⅠ雙酶切，回收目的片段并且連接，構(gòu)建出重組pGHKα-AvBD6質(zhì)粒;同理對(duì)pGHKα載

3、體進(jìn)行雙酶切。經(jīng)過(guò)SacⅠ和BglⅡ依次酶切pGHKα-AvBD6，使其線性化，用以去除Amp抗性基因。將線性化后的片段電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115中，將得到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子通過(guò)PCR鑒定，再通過(guò)雙酶切以及測(cè)序鑒定。
　　2重組AvBD6的組成型表達(dá)
　　挑取pGHKα和pGHKα-AvBD6鑒定正確的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，分別接種至5mL的YPD培養(yǎng)液中，于28℃200r/min恒溫振蕩培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期。將對(duì)數(shù)期的培養(yǎng)物以1％的比例轉(zhuǎn)接至50

4、mL發(fā)酵培養(yǎng)基瓶中培養(yǎng)48h。并經(jīng)4℃、12000g離心10min，收集上清液，即獲得重組AvBD6蛋白。通過(guò)Tricine-SDS-PAGE分析表達(dá)后的上清，差異條帶顯現(xiàn)在6kDa左右處。
　　3重組AvBD6體外抑菌活性研究
　　通過(guò)瓊脂孔穴擴(kuò)散抑菌法，用已表達(dá)的上清濃縮液進(jìn)行抗微生物活性分析，以檢測(cè)重組蛋白的體外抑菌能力，分析表明AvBD6蛋白對(duì)糞腸球菌(Enterococcus faecalis ATCC29212)

5、、大腸桿菌(Escherichia coli CMCC44102)、綠膿假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC27853）、甲型副傷寒沙門氏菌(Salmonella paratyphi ATCC9150)、巴氏桿菌(Pasteurella)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC25923)均有抑菌活性。
　　本研究是以組成型表達(dá)載體pGHKa為基礎(chǔ)，構(gòu)建重組AvBD6畢赤酵