雞AvBD7成熟肽在大腸桿菌中的表達(dá)及抗菌活性分析.pdf

1、AvBD7成熟肽是一種擁有42個(gè)氨基酸殘基的雞β-防御素，屬于陽(yáng)離子抗菌多肽(Cationicantimicrobialpeptides，CAMPs)，是雞體內(nèi)先天性和獲得性免疫的重要成分。它具有抑菌譜廣、抗菌力強(qiáng)且不易使病原微生物產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，是一種具有非常良好應(yīng)用前景的“抗生素替代品”，如何對(duì)其進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用已成為目前的研究熱點(diǎn)。
　　 為了探索雞β-防御素在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)水平及體外抑菌活性情況，本研究以雞

2、AvBD7作為研究對(duì)象，應(yīng)用基因工程技術(shù)，將人工合成的AvBD7成熟肽基因克隆并插入載體pGEX-6P-1中，構(gòu)建成功重組的pGEX-6P-AvBD7大腸桿菌工程菌。通過(guò)優(yōu)化表達(dá)條件獲得大量的可溶性融合蛋白GST-AvBD7，用Prescission蛋白酶切除GST標(biāo)簽并純化得到的雞AvBD7成熟肽具有較好的抗菌活性。具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　 1.構(gòu)建表達(dá)AvBD7成熟肽的大腸桿菌工程菌
　　 根據(jù)GenBank中

3、登記的雞β-防御素序列(登錄號(hào)DQ858344)人工合成雞AvBD7成熟肽基因序列，設(shè)計(jì)1對(duì)引物P1(5′端含有EcoRI酶切位點(diǎn))和P2(5′端含有SalI酶切位點(diǎn))用于PCR擴(kuò)增雞AvBD7成熟肽基因片段，把PCR擴(kuò)增出的雞AvBD7成熟肽基因片段和pGEX-6P-1載體分別進(jìn)行雙酶切后連接，構(gòu)建成功pGEX-6P-1-AvBD7成熟肽表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。
　　 2.雞AvBD7成熟肽的表達(dá)、純化及鑒定

4、
　　 將測(cè)序正確的E.coliBL21(DE3)/pGEX-6P-AvBD7接種于LB液體培養(yǎng)基(Amp終濃度為100μg/ml)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出GST-AvBD7融合蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)分子量約為31kD。為了提高蛋白的可溶性表達(dá)量，經(jīng)過(guò)摸索不同的表達(dá)條件發(fā)現(xiàn)，在16℃120rpm/min經(jīng)0.1mmoL的IPTG誘導(dǎo)約24h后可溶性融合蛋白GST-AvBD7得到最佳表達(dá)。將GST-AvBD7融合蛋白經(jīng)過(guò)親和層析

5、、超濾、C18ZipTip層析后進(jìn)行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析，MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析鑒定出蛋白分子量為5516Da，此分子量與形成2個(gè)二硫鍵的AvBD7成熟肽的理論分子量相符。
　　 3.雞AvBD7成熟肽的抗菌活性分析
　　 采用打孔擴(kuò)散法檢測(cè)純化得到的雞成熟肽AvBD7對(duì)各個(gè)指示菌的抑菌情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：純化得到的雞成熟肽AvBD7對(duì)黃色微球菌(NCIB8166)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)

6、、糞腸鏈球菌(ATCC29212)、大腸桿菌(CMCC44102)都有抑菌活性。但是，雞β-防御素AvBD7成熟肽對(duì)白色念珠菌(ATCC10231)和白色念珠菌(ATCC90029)無(wú)抑菌作用。用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)純化得到的雞AvBD7成熟肽(質(zhì)譜分析鑒定正確)的蛋白濃度，再根據(jù)Levengood等人的方法測(cè)量純化得到的雞AvBD7成熟肽對(duì)不同指示菌的最小抑菌濃度(MIC)，結(jié)果顯示：對(duì)黃色微球菌(NCIB8166)、金黃色葡萄球菌

7、(ATCC25923)、糞腸鏈球菌(ATCC29212)、大腸桿菌(CMCC44102)的最低抑菌濃度分別為16.875、67.5、67.5、135mg/L；用純化得到的高濃度(>540mg/L)雞AvBD7成熟肽對(duì)兩株真菌白色念珠菌(ATCC10231)和白色念珠菌(ATCC90029)進(jìn)行最低抑菌濃度實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沒(méi)有抑菌活性產(chǎn)生。由此可知，體外條件下純化得到的雞β-防御素AvBD7成熟肽只對(duì)一些特定的指示菌具有抑菌活性。