無冗余氨基酸鵝α干擾素在畢赤酵母中的表達(dá)及其生物學(xué)活性研究.pdf

1、干擾素(Interferon，IFN)是由病毒或其它干擾素誘生劑刺激機(jī)體易感細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及體細(xì)胞等）產(chǎn)生的一類具有抗病毒、抗腫瘤和增強(qiáng)免疫功能的細(xì)胞因子。在眾多干擾素類型中，α-干擾素的廣譜抗病毒能力最為顯著。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用較廣的外源蛋白真核表達(dá)系統(tǒng)之一，目前，利用該系統(tǒng)已成功表達(dá)了哺乳動物、禽類、魚類等動物干擾素。酵母培養(yǎng)基成分確定，無熱原或毒素，不易污染，成本較低，更適宜于規(guī)模生產(chǎn)蛋白，因此，利用畢赤酵母表

2、達(dá)系統(tǒng)規(guī)模化生產(chǎn)有生物學(xué)活性的干擾素具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　 為了獲得具抗病毒活性無冗余氨基酸的鵝α干擾素（GoIFN-α），在鵝肝臟組織中克隆獲得GoIFN-α基因，克隆核苷酸序列與GenBank上序號為AY524422 GoIFN-α核苷酸序列比較，同源性為100％。通過融合PCR的方法將GoIFN-α的N端準(zhǔn)確連接入pPICZαA載體的分泌信號肽序列后，構(gòu)建重組酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-GoIFN-α;重組質(zhì)粒經(jīng)Sac

3、Ⅰ線性化后，用LiCl轉(zhuǎn)化法及電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化入酵母菌GS115和X33中。甲醇誘導(dǎo)陽性重組菌96h后，檢測篩選最佳表達(dá)時(shí)間和甲醇濃度。誘導(dǎo)后菌液上清進(jìn)行鹽析處理后進(jìn)行SDS-PAGE分析，表達(dá)的蛋白為一條大小在25～35ku范圍內(nèi)彌散的表達(dá)帶且較理論值(18ku)大。用以大腸桿菌表達(dá)的GoIFN-α為抗原制備的多抗血清進(jìn)行Western blot檢測，證實(shí)表達(dá)的蛋白為GoIFN-α。經(jīng)免疫酶斑點(diǎn)技術(shù)比較，確定7號重組酵母蛋白的表達(dá)量最高。

4、
　　 為提高重組GoIFN-α蛋白的表達(dá)量，選擇7號重組酵母進(jìn)行發(fā)高密度發(fā)酵罐培養(yǎng)，并對發(fā)酵過程中的溶氧值、流加甲醇量進(jìn)行控制。發(fā)酵后菌液上清進(jìn)行鹽析處理，進(jìn)行SDS-PAGE分析，顯示高密度發(fā)酵重組酵母同樣獲得一條大小在25～35ku范圍內(nèi)彌散的蛋白表達(dá)帶。
　　 利用微量細(xì)胞病變抑制法評價(jià)了表達(dá)的重組鵝GoIFN-a的抗病毒活性。檢測搖瓶發(fā)酵重組酵母表達(dá)的GoIFN-α在DEF上抑制GPMV及VSV的活性分別為1.