豬干擾素-γ的表達(dá)、純化及生物學(xué)活性研究.pdf

1、干擾素-γ(Interferon-gamma，IFN-γ)是一種具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，主要由活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生。IFN-γ對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)具有強(qiáng)大的調(diào)節(jié)作用，是機(jī)體發(fā)揮免疫功能、清除體內(nèi)病原體不可缺少的成分，因此，IFN-γ在疾病的診斷、治療和疫苗免疫效果檢測(cè)等方面起著重大作用，是現(xiàn)代分子生物學(xué)、免疫學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。本研究依照豬IFN-γ(plFN-γ)基因序列，去除信號(hào)肽后設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增該

2、基因并克隆至原核表達(dá)載體pET-30a，構(gòu)建pET-30a-plFN-γ重組表達(dá)載體，經(jīng)PCR、雙酶切、測(cè)序鑒定正確后，轉(zhuǎn)化入寄主菌BL21(DE3)，用IPTG進(jìn)行重組plFN-γ誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)該表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明：重組plFN-γ得到正確的誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)的最佳條件為在LB培養(yǎng)基中28℃誘導(dǎo)8h，誘導(dǎo)劑濃度為0.1mmol/L。此外還發(fā)現(xiàn)，無論在何種條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，包涵體形式的重組蛋白較可溶性形式的量多，降低誘導(dǎo)

3、表達(dá)溫度可使可溶性形式的重組蛋白量增加?？扇苄缘谋磉_(dá)產(chǎn)物用鎳親和層析柱純化，再用Sephadex-G100做進(jìn)一步純化；而包涵體產(chǎn)物經(jīng)DOC洗滌、SKL變性溶解、透析復(fù)性進(jìn)行純化。純化后的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE、Western blot分析證實(shí)得到了高純度的重組plFN-γ。對(duì)純化的重組plFN-γ進(jìn)行了一系列生物活性的研究：(1)用細(xì)胞病變抑制法對(duì)純化的重組豬IFN-γ進(jìn)行抗病毒活性測(cè)定，結(jié)果表明純化的重組豬IFN-γ蛋白具有較高

4、的干擾病毒復(fù)制活性，在PK15細(xì)胞系上其對(duì)偽狂犬病毒(PRV)的抑制活性為2.0x103U.mg-1，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)O型口蹄疫病毒抑制活性為2.56x105 U.mg-1；(2)用純化的重組豬IFN-γ對(duì)培養(yǎng)的傳代細(xì)胞PKl5進(jìn)行誘導(dǎo)，結(jié)果顯示plFN-γ在高濃度時(shí)可誘導(dǎo)PK15細(xì)胞發(fā)生凋亡；(3)在體外以不同劑量的重組豬干擾素吖刺激PK15細(xì)胞和豬腹腔巨噬細(xì)胞，再用弓形蟲進(jìn)行攻擊感染，結(jié)果隨著豬干擾素γ的劑量的增大，巨噬細(xì)胞抗蟲作用增強(qiáng)，而不