速效胰島素原基因的克隆及其在畢赤酵母中的分泌表達(dá).pdf

1、作為最重要的降血糖藥物，胰島素具有巨大的市場(chǎng)需求。近年來(lái)，各國(guó)學(xué)者紛紛研究各種重組胰島素在醫(yī)療上的應(yīng)用。重組人胰島素基因曾先后在大腸桿菌和釀酒酵母(S. cerevisiae)中表達(dá)，但由于大腸桿菌和釀酒酵母自身的缺陷，表達(dá)量受到限制。畢赤酵母(Pichia pastoris)是近年發(fā)展起來(lái)的真核表達(dá)系統(tǒng)，由于其表達(dá)量高，具有翻譯后對(duì)成熟蛋白修飾等優(yōu)點(diǎn)而日益受到人們的重視。本研究的目的是克隆B9Asp小C肽人胰島素原基因并通過(guò)基因工程技

2、術(shù)構(gòu)建具有高效分泌胰島素能力的畢赤酵母工程菌株。
　　 本研究選用巴斯德畢赤酵母GS115菌株為受體菌，分泌型質(zhì)粒pPIC9k為載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9k-B9Asp ins，經(jīng)SacI線(xiàn)性化后，電擊法轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母。用MD選擇培養(yǎng)基初篩出整合型His+Mut+菌株，再利用重組菌對(duì)G418抗性的差異篩選和PCR復(fù)篩，得到了18株具有較高外源基因拷貝數(shù)的重組菌株。經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)，分別利用Tricine-SDS-PAGE、胰島

3、素放免試劑盒對(duì)酵母培養(yǎng)物中的蛋白進(jìn)行測(cè)定，證明外源基因成功分泌表達(dá)。進(jìn)一步研究了其表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，重組人胰島素前體表達(dá)量也隨之增加，86小時(shí)達(dá)高峰。優(yōu)化發(fā)酵條件后，再次用胰島素放免試劑盒檢測(cè)，證明重組人胰島素具有與胰島素標(biāo)樣相同的抗體結(jié)合能力，在100ml發(fā)酵液中表達(dá)量可達(dá)到1.9mg/L。
　　 結(jié)果表明所設(shè)計(jì)的人胰島素前體基因在畢赤酵母中獲得了正確的表達(dá)，表達(dá)的人胰島素前體可以被正確的加工和折疊。這為進(jìn)一步