漢坦病毒M1基因克隆及其在畢赤酵母系統(tǒng)中的表達(dá).pdf

1、目的：漢坦病毒(Hantavirus，HV)是腎綜合征出血熱(HemorrhagicFeverwithRenalSyndrome，HFRS)的病原體，人感染后可導(dǎo)致HFRS和漢坦病毒肺綜合征(HantavirusPulmonarySyndrome,HPS)兩種嚴(yán)重的疾病。HV的包膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，GP包括G1和G2兩種蛋白。本文將HV編碼G1的M1基因在巴氏畢赤酵母(Pichiapasto

2、ris,P.pastoris)表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行了克隆和表達(dá)，并對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。 內(nèi)容和方法：使用Vero-E6細(xì)胞系分別增殖HV漢灘型(HTN)Z10株和漢城型(SEO)L99株。待HV增殖到一定程度，即免疫熒光法檢測細(xì)胞中HV感染量達(dá)+++～++++時(shí)，提取總RNA，RT-PCR擴(kuò)增編碼G1蛋白的M1基因片段，連接入pMD18-Tsimple載體，測序驗(yàn)證目的片段。使用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、KpnⅠ對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切以獲得

3、目的片段，經(jīng)純化后，連接入經(jīng)同樣內(nèi)切酶雙酶切的畢赤酵母分泌表達(dá)載體pPICZαA，接頭測序驗(yàn)證其讀碼框架。將重組表達(dá)載體經(jīng)BstXI酶切線性化后電轉(zhuǎn)化入處于感受態(tài)的P.pastoris，重組菌株經(jīng)Zeocin篩選，將陽性重組子傳代4次以穩(wěn)定其性狀。提取重組菌株染色體DNA，PCR檢測目的片段是否整合入P.pastoris染色體。使用甲醇誘導(dǎo)法對重組菌株進(jìn)行目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，并應(yīng)用WesternBlot和DotBlot對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定

4、。 結(jié)果：M1基因RT-PCR產(chǎn)物連接入pMD18-Tsimple載體后，獲得重組質(zhì)粒pMD18T-Z10M1、pMD18T-L99M1。經(jīng)測序后與GenBank登錄的核苷酸序列進(jìn)行比較，與Z10株RNA序列(AF276987)相比，目的片段有9個(gè)堿基突變；與L99株mRNA序列(AF288298)相比，目的片段有5個(gè)堿基突變。經(jīng)限制性內(nèi)切酶KpnI、XbaI對其進(jìn)行雙酶切并定向克隆入經(jīng)同樣內(nèi)切酶雙酶切的質(zhì)粒載體pPICZotA

5、中，重組質(zhì)粒分別命名為pPICZαA-Z10M1、pPICZαA-L99M1。對此二重組質(zhì)粒進(jìn)行接頭測序，結(jié)果證實(shí)已正確定向克隆且未破壞M1基因的讀碼框架。BstXI酶切將其線性化后轉(zhuǎn)化入P.pastoris中，用Zeocin篩選陽性重組子，對其染色體進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果證實(shí)目的片段已整合入P.pastoris基因組中，將重組菌分別命名為PpX33-Z10M1株和PpX33-L99M1株。甲醇誘導(dǎo)PpX33-Z10M1株和PpX33-L

6、99M1株對G1蛋白進(jìn)行表達(dá)，對表達(dá)產(chǎn)物使用HFRS病人血清進(jìn)行WesternBlot鑒定，結(jié)果顯示非特異性條帶較多；而使用Anti-His抗體對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行DotBlot鑒定結(jié)果顯示，目的蛋白在重組菌PpX33-Z10M1株和PpX33-L99M1株有分泌表達(dá)，但產(chǎn)量較小。 結(jié)論：HVM1基因通過pPICZαA可在P.pastoris中進(jìn)行G1蛋白分泌表達(dá)，但其表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)量較小，通過多拷貝整合等方法可對其進(jìn)行高效表達(dá)，這將為基