Hepcidin20基因克隆及在畢赤酵母中的表達(dá).pdf

1、Hepcidin是一種低分子量的富含半胱氨酸的肝臟多肽激素，最初從人類血漿和尿液中分離得到。Hepcidin對(duì)體內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)有重要調(diào)節(jié)作用，hepcidin的缺乏會(huì)導(dǎo)致多種疾病。另外，hepcidin在體外表現(xiàn)出良好的抗細(xì)菌及真菌活性?；瘜W(xué)合成及從組織中提取hepcidin成本較高且存在許多困難。至今，對(duì)于在真核生物中表達(dá)像hepcidin這樣的小分子多肽的報(bào)道還很少。 酵母像細(xì)菌一樣容易進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，與高等動(dòng)物表達(dá)蛋白的方式相似，

2、因此在本研究中我們希望在酵母中高效表達(dá)有活性的重組hepcidin，在本研究中，我們?cè)诋叧嘟湍钢斜磉_(dá)了人類hepcidin多肽，并對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化。 根據(jù)hepcidin的氨基酸序列以及畢赤酵母中密碼子的偏好性，合成了全長(zhǎng)的hepcidin基因，克隆到酵母表達(dá)載體pPIC9K上并轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115菌株。在涂有合適濃度的遺傳霉素抗性平板上篩選轉(zhuǎn)化子，并經(jīng)PCR驗(yàn)證。在MM和MD平板上鑒定轉(zhuǎn)化予表型，驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)均為His+M

3、ut+。 重組畢赤酵母菌株在BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)（28℃，260 rpm），每24h加入0．5%的甲醇誘導(dǎo)。轉(zhuǎn)化空pPIC9K質(zhì)粒的菌株作為對(duì)照。Tricine-SDS-PAGE顯示2．2kD條帶，表明異源蛋白在畢赤酵母中成功表達(dá)。多肽表達(dá)水平和活性分別通過SDS-PAGE和免疫反應(yīng)檢測(cè)。 對(duì)重組酵母的培養(yǎng)及誘導(dǎo)條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明胰蛋白胨，酵母提取物，穩(wěn)定的PH對(duì)重組酵母生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)有顯著影響。28℃0．5%的甲

4、醇誘導(dǎo)48h，BMMY培養(yǎng)基與其他培養(yǎng)基相比（BMM和MM）最適合hepcidin表達(dá)。 收集誘導(dǎo)60 h的發(fā)酵液，重組多肽通過等電點(diǎn)沉淀和凝膠過濾色譜純化。含有hepcidin的部分通過反向HPLC進(jìn)一步純化。另外，Hepcidin（11min）洗脫時(shí)間與化學(xué)合成的hepcidin相同。Hepcidin的分子量與計(jì)算的分子量（2191．77Da）一致。收集的每一部分通過ELISA驗(yàn)證是否含有重組Hepc，并驗(yàn)證得到的物質(zhì)確實(shí)為