小鼠sIL-13Rα2基因克隆及在畢赤酵母菌中的表達(dá).pdf

1、哮喘發(fā)病率不斷升高，近十年西歐哮喘發(fā)病率增長(zhǎng)了近一倍，約15％的成人患哮喘，而5％的患者控制較差，臨床急需針對(duì)哮喘氣道炎癥的新方法[1]。研究哮喘動(dòng)物模型表明IL-13在誘發(fā)氣道高反應(yīng)能性（airwayhyperreactivityAHR）中起重要作用，阻斷IL-13及其通路從而促進(jìn)哮喘的治療?？扇苄訧L-13受體（sIL-13Rα2）是免疫炎癥中重要的調(diào)節(jié)者，它能下調(diào)或者增強(qiáng)IL-13信號(hào)通路和因子反應(yīng)?？扇苄匀诤系鞍譻IL-13Rα

2、2可在體液中與IL-13結(jié)合，從而限制IL-13與其細(xì)胞膜受體的結(jié)合，抑制其作用并減少單克隆抗體治療的變應(yīng)原性。目前用sIL-13Rα2靶向治療哮喘小鼠國(guó)內(nèi)外還未見報(bào)道。本研究用分子克隆技術(shù)克隆小鼠sIL-13Rα2基因，并構(gòu)建酵母表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)sIL-13Rα2蛋白，為哮喘治療奠定基礎(chǔ)。
　　目的：克隆小鼠sIL-13Rα2基因并構(gòu)建酵母表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染畢赤酵母GS115菌株中進(jìn)行sIL-13Rα2蛋白的表達(dá)。

3、r>　　方法：從小鼠脾臟細(xì)胞中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用分段PCR的方法克隆小鼠sIL-13Rα2基因，目的基因經(jīng)鑒定后定向克隆至酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZα-A，并轉(zhuǎn)染畢赤酵母GS115菌株，加入酵母培養(yǎng)基和誘導(dǎo)劑進(jìn)行進(jìn)行目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。利用SDS-PAGE和Western分析目的蛋白表達(dá)的結(jié)果。
　　結(jié)果：RT-PCR方法克隆出933bp大小的可溶性IL-13Rα2目的基因片段，測(cè)序結(jié)果與genbank登陸的基因大小

4、相一致，目的基因成功連接至pPICZα-A/sIL-13Rα2酵母表達(dá)載體，并成功轉(zhuǎn)染至畢氏酵母菌，誘導(dǎo)表達(dá)出可溶性IL-13Rα2目的蛋白。目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE和Western分析大小為36.2kD，與protein文庫相一致。
　　結(jié)論：已成功克隆和構(gòu)建出小鼠sIL-13Rα2目的基因及酵母表達(dá)載體，并利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出了小鼠可溶性IL-13Rα2目的蛋白，為應(yīng)用sIL-13Rα2蛋白治療哮喘及其他過敏性疾病奠定