大鼠胰島素原基因編碼序列的克隆及表達(dá).pdf

1、糖尿病是由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的常見(jiàn)病，但目前在研究糖尿病發(fā)病機(jī)理過(guò)程中，缺乏動(dòng)物胰島素作為研究試劑，只能用人的胰島素來(lái)替代，造成很多問(wèn)題。因此，克隆和表達(dá)大鼠胰島素具有重要的應(yīng)用價(jià)值。我們使用基因工程的方法克隆大鼠胰島素原基因編碼序列并在大腸桿菌中進(jìn)行高效表達(dá)。
　　 我們提取大鼠胰腺組織的總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，擴(kuò)增大鼠胰島素編碼基因的外顯子序列，克隆入pGEM-T Easy載體。測(cè)序證實(shí)序列正確后，將目的基因

2、插入融合型原核表達(dá)載體pQE-30Xa，轉(zhuǎn)化入E.coli M15[pREP4]，進(jìn)行融合表達(dá)。SDS-PAGE電泳查看表達(dá)產(chǎn)物大小和表達(dá)量，Western-blotting進(jìn)一步鑒定。將重組質(zhì)粒pQE-30Xa/proinsulin優(yōu)化表達(dá)條件進(jìn)行大量表達(dá)，Proinsulin的表達(dá)量達(dá)到19mg/L培養(yǎng)基。重組蛋白胰島素原占菌體蛋白的28.24％。目的蛋白含6×His純化標(biāo)簽，可以經(jīng)金屬螯合親和層析吸附于Ni2+-IDA樹(shù)脂層析柱，