人胰島素原基因的設計、分子克隆、構(gòu)建及其對馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、糖尿病是繼心血管疾病、癌癥之后致殘率、致死率最高的第三大疾病，世界衛(wèi)生組織已將防治這一疚病列為全球保護人類健康的重要問題之一。胰島素是治療糖尿病的最有效的藥物?，F(xiàn)在使用的胰島素多是通過細菌或酵母表達系統(tǒng)得劍的，相對于大量普通糖尿病人群及其需終身用藥而言，其生產(chǎn)成本仍然較高，從而限制了胰島素的廣泛應用。而利用植物生產(chǎn)胰島素可有效的彌補這一不足。因此，本實驗構(gòu)建了含人胰島素原基因的植物表達載體，并經(jīng)農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化馬鈴薯品種大西洋，為人胰島素

2、原基因在馬鈴薯植株中表達奠定了基礎。主要研究結(jié)果如下：
　　 1、克隆了馬鈴薯塊莖專一性啟動子patatinⅠ啟動子基(GU168944)，經(jīng)測序分析，該克隆片段為1100bp，包含有增強子、CAAT box、TATA box和轉(zhuǎn)錄起始點序列。與GenBank中公布的已知序列(CQ876983)有96％的同源性。
　　 2、根據(jù)是否含有信號肽基因，分別設計合成了帶有NcoI特定酶切位點的2條引物，亞克隆了patatinⅠ

3、啟動子，并與pMD-8T載體連接，得到2個重組子pGPP05(不含信號肽)和pGPP06(含信號肽)。
　　 3、根據(jù)馬鈴薯的偏愛密碼子和GenBank中人胰島素原的氨基酸序列，并在人胰島素原序列的前面加入NcoI酶切位點，后面加上終止密碼子和BstEII的酶切位點，設計合成了人胰島素原基因，并與pMD-18T載體連接，得到重組子pMD-hlNS。
　　 4、構(gòu)建了含patatinⅠ啟動子與人胰島素原基囚的植物表達載體p

4、l301P05h(不含信號肽)和pl301P06h(含信號肽)。通過凍融法，將構(gòu)建好的表達載體導入農(nóng)桿菌菌株LBA4404，經(jīng)PCR鑒定，獲得了轉(zhuǎn)化菌株。
　　 5、以大西洋、費烏瑞它、夏波蒂和甘農(nóng)薯2號4種馬鈴薯試管曲莖段為材料，進行4個品種莖段的離體再生研究，結(jié)果表明大西洋的最適愈傷組織培養(yǎng)基為MS+2.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA；夏波蒂和甘農(nóng)薯2號為MS+2.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA，F(xiàn)avo

5、rita為MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA。大西洋和甘農(nóng)薯2號的最適愈傷組織分化培養(yǎng)基為MS+2.5 mg/L6-BA+5.0mg/LGA3；夏波蒂為MS+3.5mg/L6-BA+10mg/L GA3；Favorite為MS+2.5mg/L6-BA+0.1 mg/L NAA+10mg/L GA3。
　　 6、農(nóng)桿菌介導的馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化的最佳條件是：大西洋莖段外植體，預培養(yǎng)2d，用處于對數(shù)生長期OD600=0.5