大豆維生素B-,6-合成關(guān)鍵酶基因的克隆及對(duì)馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、電子克隆(in silico cloning)是隨著基因組計(jì)劃和EST計(jì)劃實(shí)施而發(fā)展起來的利用生物信息學(xué)手段進(jìn)行基因克隆的新方法。相對(duì)于傳統(tǒng)的基因克隆方法具有投入低、速度快、技術(shù)要求不高和針對(duì)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。隨著人類基因組計(jì)劃的實(shí)施，研究人員利用電子克隆的方法已經(jīng)克隆了許多人的功能基因。但由于受序列資料的限制，植物領(lǐng)域的電子克隆還鮮有報(bào)道。隨著EST數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷豐富和完善，利用生物信息學(xué)的方法進(jìn)行植物基因的電子克隆已經(jīng)成為可能。 本

2、文以擬南芥基因cDNA序列為信息探針，對(duì)大豆EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源檢索篩選，克隆了大豆維生素B<,6>合成過程中關(guān)鍵酶基因——吡哆醛激酶基因和吡哆醇生物合成蛋白基因，并將吡哆醇生物合成蛋白基因?qū)︸R鈴薯進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化。本研究旨在根據(jù)物種間基因序列的同源性，建立一條跨物種電子克隆新基因的有效途徑，并采用代謝工程的方法對(duì)馬鈴薯的品質(zhì)進(jìn)行改良。研究結(jié)果如下：l大豆吡哆醛激酶基因(PK)的克隆與分析以擬南芥吡哆醛激酶基因的cDNA序列為信息探針，對(duì)

3、大豆(Glycine max)EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源搜索和序列拼接，獲得了全長(zhǎng)為1102bp的大豆吡哆醛激酶的基因序列(GenBank登陸號(hào)為DOQOO6813)。該cDNA序列的開放閱讀框(ORF)位于第119-1045位，推測(cè)編碼308個(gè)氨基酸。為了進(jìn)一步驗(yàn)證電子克隆序列的正確性，在起始密碼子和終止密碼子區(qū)域設(shè)計(jì)特異引物，經(jīng)RT-PCR．克隆和序列分析驗(yàn)證，結(jié)果表明與電子克隆序列一致。 將大豆(Glycine max)PK基因

4、編碼的蛋白序列與馬鈴薯(Solanum tuberosum，AAY85186)、擬南芥(Arabidopsis thaliana，AAK94021)、水稻(Oryza sativa，ABA99785)、小麥(Triticum aestivum，從R00318)和油菜(Brassica napus，ABE73472)的吡哆醛激酶蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其一致性分別為：81﹪、75﹪、78﹪、79﹪和76﹪。比對(duì)結(jié)果說明在植物中該基因編碼的蛋

5、白質(zhì)存在顯著的相似性。根據(jù)蛋白比對(duì)結(jié)果繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹基本代表了它們?cè)诮?jīng)典分類上的地位。 采用半定量RT-PCR方法分析光照時(shí)間對(duì)大豆PK基因表達(dá)量的影響，結(jié)果顯示，PK基因的表達(dá)量隨著光照時(shí)間的增加基本沒有變化，證明大豆PK基因不受強(qiáng)光調(diào)控。組織表達(dá)譜分析結(jié)果表明PK基因在大豆根莖葉中都有表達(dá)。 2大豆吡哆醇生物合成蛋白基因㈣的克隆與分析以擬南芥吡哆醇生物合成蛋白基因的cDNA序列為信息探針，對(duì)大豆(Glycine m

6、ax)EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源搜索和序列拼接，獲得了全長(zhǎng)為1280bp的大豆吡哆醇生物合成蛋白的基因序列(GenBank登陸號(hào)為DQ139265)。該cDNA序列的開放閱讀框(ORF)位于第20-955位，推測(cè)編碼311個(gè)氨基酸。為了進(jìn)一步驗(yàn)證電子克隆序列的正確性，在起始密碼子和終止密碼子區(qū)域設(shè)計(jì)特異引物，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增、基因組：PCR擴(kuò)增、分子克隆和序列分析驗(yàn)證，結(jié)果表明與電子克隆序列一致。 將大豆(Glycine max)P

7、DX基因編碼的蛋白序列與日本百脈根(Lotus corniculatus var．iaponicus，AAZ67141)、煙草(Nicotiana tabacum，AAS92255)、擬南芥(Arabidopsis thaliana，AAM66972)、截形苜蓿(Medicago truncatula，AAZ67140)、小麥(Triticum aestivum，AAZ94411)和水稻(Oryza sativa，EAZ38383)的吡

8、哆醇生物合成蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其一致性分別為：93﹪、92﹪、92﹪、92﹪、85﹪和70﹪。比對(duì)結(jié)果說明在植物中該基因編碼的蛋白質(zhì)存在顯著的相似性。根據(jù)蛋白比對(duì)結(jié)果繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹基本代表了它們?cè)诮?jīng)典分類上的地位。 半定量RT-PCR結(jié)果顯示，PDX基因的表達(dá)量隨著光照時(shí)間的增加基本沒有變化，證明大豆PDX基因不受強(qiáng)光調(diào)控。組織表達(dá)譜分析結(jié)果表明PDX基因在大豆根莖葉中都有表達(dá)。 3 大豆PDX基因?qū)︸R鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)