生菜維生素E生物合成途徑基因LsHPPD和LsHPT的克隆及轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、維生素E是一類脂溶性抗氧化劑的統(tǒng)稱，可分為生育酚和生育三烯酚兩大類，它們對(duì)于人體的營養(yǎng)健康具有重要意義。維生素E只能在光合自養(yǎng)生物（如高等植物和藍(lán)藻）中合成。人體日常所需的維生素E主要是通過植物類食物和藥物來補(bǔ)充。生菜是一種被廣泛食用的蔬菜，利用遺傳工程的方法改良生菜維生素E的合成途徑，并提高維生素E的含量，對(duì)于提高其營養(yǎng)價(jià)值具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本文選擇常見生菜品系Lactuca sativaL. var. longifolia（rom

2、aine lettuce，羅蔓生菜）作為研究對(duì)象，探索維生素E生物合成途徑上的三個(gè)關(guān)鍵酶：4-羥苯丙酮酸二加氧酶（4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，HPPD）、尿黑酸植基轉(zhuǎn)移酶（homogentisate phytyltransferase, HPT）和γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶（γ-tocopherol methyltransferase，γ-TMT）對(duì)生菜維生素E合成途徑的影響。具體工作包括以下四個(gè)方

3、面：
　　1.生菜LsHPPD和LsHPT基因的克隆及分析。從生菜中克隆了編碼4-羥苯丙酮酸二加氧酶和尿黑酸植基轉(zhuǎn)移酶的基因, LsHPPD和LsHPT（GenBank登錄號(hào)分別為FJ194493和FJ194492）。LsHPPD基因的cDNA序列全長1,743 bp，編碼一個(gè)含446個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。通過蛋白質(zhì)氨基酸序列多重比對(duì)發(fā)現(xiàn)，LsHPPD與蒺藜苜蓿HPPD序列具有77％的同源性。已知HPPD需要與Fe2+相互作用才能具備

4、正常的催化活性，根據(jù)蛋白質(zhì)序列分析以及三維結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果，推測出LsHPPD的His-222、His-304和Glu-390是其與Fe2+相互作用的氨基酸殘基。LsHPT基因的cDNA序列全長1,670 bp，編碼一個(gè)含395個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。LsHPT與擬南芥HPT具有68%的同源性。據(jù)報(bào)道擬南芥和菠菜的HPT蛋白質(zhì)都定位于葉綠體膜表達(dá)。在對(duì)LsHPT的氨基酸序列進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)：LsHPT是一種具有高度疏水性的蛋白質(zhì)，在其N端有一段7

5、5個(gè)氨基酸的葉綠體定位信號(hào)序列，推測LsHPT蛋白可能也定位于葉綠體膜表達(dá)。Southern blot分析表明這兩個(gè)基因在生菜基因組中都是以低拷貝形式存在的。組織表達(dá)分析結(jié)果表明，LsHPPD和LsHPT基因在種子中的表達(dá)量最高，在第5-10片葉片中次之，在第1-2片葉片、根、子葉和莖中表達(dá)量較低。在LsHPPD和LsHPT基因表達(dá)水平較高的組織中生育酚總量一般也相對(duì)較高。對(duì)生菜分別進(jìn)行強(qiáng)光、干旱及低溫等脅迫處理以及茉莉酸甲酯、脫落酸等

6、激素誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)，LsHPPD和LsHPT基因的表達(dá)量和生育酚含量均顯著提高。上述結(jié)果表明，LsHPPD和LsHPT基因?qū)τ诓煌M織中以及不同脅迫誘導(dǎo)條件下生菜維生素E的合成具有關(guān)鍵作用。
　　2.LsHPPD和LsHPT基因在生菜中的瞬時(shí)表達(dá)分析。為了進(jìn)一步研究LsHPPD和LsHPT基因?qū)ι司S生素 E合成的影響，采用農(nóng)桿菌滲入法（Agroinfiltration）對(duì)生菜進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，使生菜中LsHPPD和LsHPT基因的表達(dá)量

7、在短時(shí)間內(nèi)迅速提高。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的結(jié)果表明，LsHPPD和LsHPT基因表達(dá)量（用2-ΔΔCt值表示）分別達(dá)到對(duì)照的13.18倍和12.47倍。HPLC檢測結(jié)果表明LsHPPD基因的瞬時(shí)表達(dá)可使α-生育酚的含量提高到25.57±1.37μg/g FW，為對(duì)照的5.37倍；LsHPT基因的瞬時(shí)表達(dá)可使α-生育酚的含量提高到88.44±3.15μg/g FW，為對(duì)照的18.58倍。瞬時(shí)表達(dá)的結(jié)果表明，提高LsHPPD和LsHPT

8、基因的表達(dá)水平可以促進(jìn)生育酚的合成，其中LsHPT基因在提高生育酚含量方面的作用效果又要優(yōu)于LsHPPD基因。
　　3.LsHPPD和LsHPT基因在擬南芥和生菜中的穩(wěn)定表達(dá)分析。在瞬時(shí)表達(dá)的基礎(chǔ)上，為了研究LsHPPD和LsHPT基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化對(duì)于維生素E合成途徑的影響是否與之相似，采用LsHPPD和LsHPT基因?qū)M南芥進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。在獲得的表達(dá) LsHPPD和LsHPT基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中，α-生育酚和γ-生育酚的總量可

9、分別提高到野生型植株的1.51倍和2.09倍，說明LsHPPD和LsHPT基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化可以促進(jìn)植株中維生素E的合成。繼而將 LsHPPD和LsHPT基因用于生菜的遺傳轉(zhuǎn)化，以期提高其中生育酚的含量，從而改善生菜的營養(yǎng)品質(zhì)。結(jié)果表明：在過量表達(dá)LsHPPD基因的生菜中，α-生育酚和γ-生育酚的總量提高至11.57±0.39μg/g FW，是野生型植株的1.70倍；在過量表達(dá)LsHPT基因的生菜中，其總量可提高至17.77±0.41μg/

10、g FW，是野生型植株的2.61倍。在T1代轉(zhuǎn)基因植株中，目的基因的表達(dá)量和生育酚含量仍保持較高的水平，表明其具有遺傳穩(wěn)定性。
　　4.擬南芥AtHPT和AtTMT雙基因共轉(zhuǎn)化生菜的研究。過量表達(dá)LsHPPD和LsHPT基因，尤其是其中的LsHPT基因，可以提高生菜中α-生育酚和γ-生育酚的總量。然而這兩個(gè)基因的過量表達(dá)卻無法改變生菜中生育酚的組成。將AtHPT和AtTMT基因構(gòu)建雙基因共轉(zhuǎn)化載體，對(duì)生菜進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。結(jié)果表明在轉(zhuǎn)

11、基因生菜中，生育酚總量可提高至13.62±0.26μg/g FW，α-生育酚:γ-生育酚的比值提高至4.24，最終可使維生素E活性提高到對(duì)照的3.51倍。因而通過同時(shí)過量表達(dá)AtHPT和AtTMT基因可以使生育酚總量和其中α-生育酚所占的比例都有所提高，從而提高生菜中總維生素E的活性。
　　本文成功克隆了生菜 LsHPPD和LsHPT基因，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化分別獲得生菜及擬南芥的轉(zhuǎn)基因植株，使其中維生素E的含量和活性都顯著