花生Oleosin基因啟動(dòng)子的特異性表達(dá)研究及維生素E合成相關(guān)基因PK和VTE3的克隆、遺傳轉(zhuǎn)化和功能分析.pdf

1、StudyontheSpecificExpressionofPromoterofOleosinGeneandCloning，一‘r—n‘1”1Genetic～1Fanstormationand量。UnCtiOnalAnalysisofVitaminESynthesisRelatedGenes(PK、VTE3)inPeanutThesissubmittedtoQingdaoAgriculturalUniversityInFulfillme

2、ntoftheRequirementfortheDegreeofMasterofScienceFanQiancheng(DepartmentofLifeSciences)Supervisor：ProfWangJingshanQingdaoChinaJune，2013青島農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要花生Oleosin基因啟動(dòng)子的特異性表達(dá)研究及維生素E合成相關(guān)基因雕和功匹歲的克隆、遺傳轉(zhuǎn)化和功能分析土；當(dāng)面捅要本研究利用花生Oleosin基因

3、啟動(dòng)子與GUS基因構(gòu)建了融合表達(dá)載體，通過花粉管通道法導(dǎo)入花生并分析其表達(dá)特性。另一方面，從花生中克隆與維生素E合成相關(guān)基因2甲基6植基1，4苯醌甲基轉(zhuǎn)移酶基因(VTE3)和植醇激酶基因(PK)的全長eDNA序列，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建組成型表達(dá)載體，進(jìn)行遺傳毒4JC，使其在花生中超量表達(dá)，旨在創(chuàng)造維生素E含量和活性顯著提高的花生新種質(zhì)。主要研究結(jié)果如下：1利用花生Oleosin基因啟動(dòng)子與GUS基因構(gòu)建了表達(dá)載體pCAMBIAl301Oleo

4、sin，通過花粉管通道法導(dǎo)入花生。對To代植株進(jìn)行了PCR鑒定和GUS組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示：50株T0代植株有9株能擴(kuò)增出目的條帶，PCR陽性率為18％，9株P(guān)CR陽性轉(zhuǎn)基因植株中有5株的子葉能被GUS染色。對GUS染色成陽性的轉(zhuǎn)基因植株的子葉進(jìn)行切片觀察，結(jié)果顯示Oleosin基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因在油體蛋白中表達(dá)。證明這種方法在花生中是一條快速、有效的轉(zhuǎn)化方法，同時(shí)為花生種子特異表達(dá)載體的構(gòu)建和無標(biāo)記系統(tǒng)的建立奠定了基礎(chǔ)。2從

5、花生栽培種魯花11中克隆得到VTE3和脹基因。其中VTE3基因可分為兩類，分別命名為VTE3J和唧2，都有2個(gè)內(nèi)含子，其eDNA均含有長1056bp的完整ORF，編碼產(chǎn)物含351個(gè)氨基酸殘基，兩基因氨基酸序列的同源性為986％。麒基因也可分為兩類，分別命名為豚J和豚2，都有5個(gè)內(nèi)含子，其cDNA均含有長948bp的完整ORF，編碼產(chǎn)物含315個(gè)氨基酸殘基，兩基因氨基酸序列的同源性為9841％。3為了研究這2個(gè)基因在花生中的作用，分別構(gòu)建

6、了VTE3和麒基因的過表達(dá)載體以及VTE3的反義載體。利用花粉管通道法和農(nóng)桿菌侵染法，分別將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化花生。利用PCR對T0代幼苗進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果顯示利用花粉管通道法將各載體轉(zhuǎn)化花生后，PCR陽性率分別為；433％、211％、833％、643％、400％。利用農(nóng)桿菌侵染法將各載體轉(zhuǎn)化花生后已獲得一批卡那霉素抗性苗，但尚未進(jìn)行分子鑒定。4彳0用熒光定量PCR研究了VTE3和麒基因在低溫、高鹽、PEG模擬干旱和外源施加激素ABA