水稻葉片衰老特異性啟動子的克隆和利用及劍葉早期衰老上升表達基因的鑒定.pdf

1、水稻是人類最重要的糧食作物之一。雖然目前雜交水稻的推廣很大程度上解決了世界人民的糧食問題，但是一些優(yōu)良品種尤其是一些秈型品種在中后期衰老快，限制了更多有機物的形成和積累，不利于結(jié)實率和千粒重等產(chǎn)量相關(guān)性狀的提高。解決這個問題的關(guān)鍵是了解葉片衰老的機制，創(chuàng)造延緩水稻葉片衰老的途徑，進而提高有機物在籽粒中的積累。利用衰老特異性啟動子驅(qū)動細胞分裂素基因表達、抑制衰老上升基因表達或者過量表達衰老下降基因都有可能實現(xiàn)持綠性水稻的目標。本實驗針對這

2、個問題，克隆鑒定了水稻來源的衰老特異性啟動子，并用該啟動子驅(qū)動農(nóng)桿菌來源的細胞分裂素合成酶基因轉(zhuǎn)化秈稻和粳稻，篩選持綠性家系，并且構(gòu)建了中花11劍葉的早期衰老上升表達文庫，主要結(jié)果如下： 1.克隆水稻啟動子PSAG39，通過報告基因GUS融合表達載體轉(zhuǎn)化水稻鑒定其時空組織特異性表達譜。經(jīng)過組織化學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)其在葉、莖、根、花、穎殼及未成熟種子的種皮、愈傷組織中表達，在成熟種子及胚乳中不表達，而且在葉片衰老晚期表達量達到高峰，揭示該

3、啟動子是葉片衰老特異性，而且可以應(yīng)用于基因工程育種改良研究。 2.鑒于啟動子序列預(yù)測出多種激素響應(yīng)相關(guān)的順式作用位點，本實驗用瞬時表達體系檢測激素和冷脅迫對一系列5’端缺失啟動子的表達情況，并且研究了缺失啟動子的衰老特異性表達譜，確定PSAG39啟動子的衰老相關(guān)的順式作用位點存在的區(qū)段。通過凝膠阻滯實驗鑒定了可能對衰老上升表達起作用的順式因子。揭示順式作用位點HBOXCONSENSUSPVCHS和WRKY710S與葉片衰老特異表

4、達有關(guān)。 3.在粳稻中成功轉(zhuǎn)化了PSAG39:IPT表達系統(tǒng)，繁殖并篩選了單拷貝插入的轉(zhuǎn)基因純合家系，5個以牡丹江8＃為受體：MT1、MT2、MT3、MT4、MT5；3個以中花11為受體：ZT1、ZT2、ZT3。 4.研究轉(zhuǎn)PSAG39:IPT表達系統(tǒng)的陽性轉(zhuǎn)基因水稻的葉片持綠性變化，發(fā)現(xiàn)持綠性增強，且這個表型與外源基因IPT的表達量共分離。 5.調(diào)查了轉(zhuǎn)化植株表達的細胞分裂素在光照下對幼苗生長及抽穗期產(chǎn)生的影響

5、，PSAG39:IPT的轉(zhuǎn)基因植株表達細胞分裂素在一定光照條件下(14小時或24小時)影響了種子剛萌發(fā)時芽的生長，但是不會影響莖桿的繼續(xù)伸長。在長日照條件下，轉(zhuǎn)基因中花11植株表達細胞分裂素刺激了OsMADS50的表達，從而提前開花。 6.探明結(jié)實期間碳氮代謝水平是否發(fā)生變化，通過分析純合家系ZT1可溶性糖含量和全氮含量發(fā)現(xiàn)，糖及氮素水平的改變引起葉片的庫源轉(zhuǎn)換發(fā)生變化從而引發(fā)葉片衰老。 7.完成純合家系的隨機區(qū)組試驗，

6、每個小區(qū)設(shè)置三個重復(fù)，調(diào)查轉(zhuǎn)基因植株的持綠性和其他農(nóng)藝性狀。轉(zhuǎn)基因陽性株系ZT1、ZT2的生物學(xué)產(chǎn)量相對其陰性株系降低約8-10％，千粒重增加約5-9％。 8.以綠色葉片為driver，早期衰老葉片為tester，用抑制差減雜交法完成水稻劍葉早期衰老特異基因文庫的構(gòu)建，以driver和tester的總RNA為探針分別進行文庫克隆的Macroarray雜交，篩選出815個差異表達的ESTs。通過生物信息學(xué)分析(陽性克隆聚類及GO分

7、析)，一共確定了533個單基因，其中183個有GO注釋，涉及大分子物質(zhì)代謝、調(diào)控蛋白質(zhì)合成、能量代謝、調(diào)節(jié)基因、解毒、病原性和逆境、細胞骨架構(gòu)成和花發(fā)育。121個與已報導(dǎo)過的持綠相關(guān)QTLs共線性，其余是功能未知的新基因。 9.從文庫中隨機挑選50個陽性克隆的Northern雜交驗證了差減雜交的效率和準確度，達到60％以上。對幾個未知功能的基因進行定量PCR實驗，發(fā)現(xiàn)它們不僅在自然衰老早期上升表達，而且不同程度的受到激素的誘導(dǎo)。