豬Siglec-1基因啟動(dòng)子克隆及其在肺泡巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)的驗(yàn)證.pdf

1、豬肺泡巨噬細(xì)胞（porcine alveolar macrophage，PAM）是豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染的靶細(xì)胞。為使抗PRRSV的外源基因在靶細(xì)胞中高效、特異性表達(dá)，培育出豬的抗PRRS轉(zhuǎn)基因新品系，篩選豬PAM特異性表達(dá)基因啟動(dòng)子是非常重要的。真核生物基因在無(wú)轉(zhuǎn)錄因子參與時(shí)，RNA聚合酶自身不能啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，故處于不

2、表達(dá)狀態(tài)，只有當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在其識(shí)別的DNA序列上后，基因才開始表達(dá)。因此，對(duì)特異表達(dá)基因啟動(dòng)子的研究既包括啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件確定又包含轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控作用。
　　 研究表明豬唾液酸結(jié)合的免疫球蛋白樣凝集素1（sialoadhesin，Sn;又稱為Siglec-1）是介導(dǎo)PRRSV黏附和內(nèi)化巨噬細(xì)胞的關(guān)鍵受體，在豬肺泡巨噬細(xì)胞上高表達(dá)。本研究采用啟動(dòng)子缺失表達(dá)載體，研究了Siglec-1基因啟動(dòng)子在豬肺泡巨噬細(xì)胞、脂肪前體細(xì)胞、成

3、纖維細(xì)胞和腎細(xì)胞的表達(dá)活性，獲得具有特異性調(diào)控功能的啟動(dòng)子區(qū)，并初步研究了其在肺泡巨噬細(xì)胞高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。方法如下:
　　 1 RACE技術(shù)確定Siglec-1基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)
　　 通過(guò)NCBI下載豬Siglec-1基因mRNA序列，并設(shè)計(jì)5'-RACE特異性引物。依據(jù)Smarter RACE kit克隆出Siglec-1基因5'喘轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)，確定其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為C，位于起始密碼子ATG上游88bp處。Sig

4、lec-1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的確定為研究該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。
　　 2Siglec-1基因啟動(dòng)子缺失表達(dá)載體構(gòu)建
　　 首先，利用生物信息學(xué)方法查找豬Siglec-1基因5'端調(diào)控序列，預(yù)測(cè)出啟動(dòng)子及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)大概位置;其次，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增不同長(zhǎng)度缺失片段的啟動(dòng)子，分別連接到螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-Basic上，經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定成功構(gòu)建了九種重組表達(dá)載體pLUC173、pLUC574、pLUC

5、691、pLUC740、pLUC869、pLUC901、pLUC1444、pLUC2188、 pLUC3412。
　　 3缺失啟動(dòng)子活性分析及細(xì)胞特異性驗(yàn)證
　　 將啟動(dòng)子缺失表達(dá)載體與海腎熒光素酶報(bào)告載體pRL-TK按照20∶1共轉(zhuǎn)染肺泡巨噬細(xì)胞，24小時(shí)后，通過(guò)雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性，以pRL-TK熒光活性值為內(nèi)參照，并將pGL3-Basic的基礎(chǔ)活性值定為1，分析缺失啟動(dòng)子活性，篩選出核心啟動(dòng)子區(qū)為pL

6、UC173、活性最高啟動(dòng)子為pLUC869。同樣條件下將這兩種載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染其他非巨噬細(xì)胞（豬腎細(xì)胞、脂肪前體細(xì)胞、豬胎兒成纖維細(xì)胞）確定細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子片段。
　　 4啟動(dòng)子突變分析
　　 通過(guò)生物信息學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)研究相結(jié)合，初步探明轉(zhuǎn)錄因子PU.1對(duì)于Siglec-1基因肺泡巨噬細(xì)胞高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，定點(diǎn)突變PU.1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)后導(dǎo)致Siglc-1基因表達(dá)下調(diào)，提示轉(zhuǎn)錄因子PU.1可能對(duì)于Siglec-1基因