大豆維生素生物合成相關酶基因的克隆及對馬鈴薯的遺傳轉化.pdf

1、電子克隆(in silico cloning)，又稱虛擬克隆(virtual cloning)，是近年來隨著基因組計劃和EST計劃而日益發(fā)展起來的克隆基因的新方法。但由于受到序列資料豐富度的限制，在植物基因克隆領域應用仍不多。隨著EST數據庫的不斷豐富和完善，利用生物信息學的方法進行某些植物基因的電子克隆已經成為可能。 本文以擬南芥基因cDNA序列為信息探針，對大豆EST數據庫進行同源檢索篩選，克隆了大豆維生素E合成過程中酪氨酸

2、轉氨酶基因TAT和維生素C代謝過程中脫氫抗壞血酸還原酶基DHAR，對大豆不同組織部位和不同光照時間處理的葉片分別進行這兩個基因的半定量RT-PCR分析和組織表達譜分析，并以得到的TAT基因對馬鈴薯進行遺傳轉化。旨在根據物種間基因序列的同源性，建立一條跨物種電子克隆基因的有效途徑，并通過基因工程的方法改良馬鈴薯的品質。研究結果如下： 1 大豆TAT基因的克隆與分析以擬南芥酪氨酸轉氨酶基因TAT的cDNA序列為信息探針，BLAST檢

3、索GenBank中的大豆EST數據庫，獲得了全長為1709bp的大豆酪氨酸轉氨酶基因TAT的cDNA序列(GenBank登錄號：DQ003328)。該cDNA序列的開放閱讀框(ORF)位于第226-1503位，ORF前存在TAA或TGA等多個終止密碼子，3’末端存在AATAAA加尾信號。推測該cDNA序列編碼425個氨基酸，預測其相對分子量為46.7KDa，等電點pI=5.00。為了進一步驗證電子克隆序列的正確性，在起始密碼子和終止密碼

4、子區(qū)域設計特異引物，經RT-PCR進行克隆、序列分析驗證，結果表明與電子克隆序列一致。 將大豆(Glycine max)TAT基因推測的氨基酸序列與擬南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)、彩葉草(Solenostemon scutellarioides)、截形苜蓿(Medicago truncatula)等植物該基因對應的氨基酸序列進行比較發(fā)現，氨基酸序列的一致性分別為：97﹪、94

5、﹪、86﹪和80﹪，比對結果說明該蛋白質和其它植物之間的確存在顯著的相似性。根據氨基酸序列多重對齊的結果繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹基本上代表了它們在經典分類上的地位。 采用半定量RT-PCR分析光照時間的長短對大豆TAT基因表達量的影響，結果表明隨著光照時間的增加，TAT基因的表達量也有明顯的提高。組織表達譜分析結果表明該基因在大豆的葉莖中都有表達，但在根中幾乎不表達。 2 大豆DHAR基因的克隆與分析以擬南芥脫氫抗壞血酸還原酶基

6、因DHA的cDNA序列為信息探針，搜索GenBank的大豆EST數據庫，通過EST拼接獲得了955bp的大豆DHAR的cDNA序列(GenBank登錄號：DQ006810)，該序列僅有一個開放閱讀框，位于第36-815位，推測編碼259個氨基酸，預測其理論相對分子量為28．9KDa，理論等電點pl=5.06。根據電子克隆的結果設計特異引物，通過RT-PCR的方法獲得了大豆DHAR的cDNA克隆，經測序發(fā)現實驗得到的序列與電子克隆得到的序

7、列一致。 將大豆(Glycine max)DHAR基因與擬南芥(Arabidopsis thaliana)、截形苜蓿(Medicagotruncatula)、百脈根(Lotus corniculatus)、花椰菜(Brassica oleracea)、西紅柿(Lycopersiconesculentum)、水稻(Orvza sativa)等植物的該基因進行同源性比較，發(fā)現在氨基酸水平上有很高的一致性，分別為66.28﹪、79.9

8、2﹪、81.37﹪、67.05﹪、63.06﹪、60.66﹪。根據氨基酸序列多重對齊的結果繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹基本上代表了它們在經典分類上的地位。 半定量RT-PCR分析結果表明，大豆DHA尺基因的表達量隨光照時間的增加而提高。大豆DHAR基因在根中幾乎不表達，而在葉莖中的表達量遠高于根。3大豆TAT基因對馬鈴薯的遺傳轉化通過農桿菌LBA4404介導，用大豆酪氨酸轉氨酶基因TAT轉化馬鈴薯葉片和莖段，通過卡那霉素抗性篩選，獲得了33