米黑霉脂肪酶在畢赤酵母中的表達(dá)及分子改造.pdf

1、脂肪酶是重要的工業(yè)酶制劑，在食品、制藥、洗滌、合成等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。米黑根毛霉脂肪酶(RML:Rhizomucormieheilipase)已經(jīng)在結(jié)構(gòu)分析、催化反應(yīng)、工業(yè)應(yīng)用等多方面得到研究。研究者在上游通過(guò)定向進(jìn)化、蛋白結(jié)構(gòu)分析，在下游通過(guò)發(fā)酵條件和反應(yīng)條件的優(yōu)化提高RML在工業(yè)催化反應(yīng)中的酶活。天然的RML包括信號(hào)肽(24個(gè)氨基酸)、前導(dǎo)肽(70個(gè)氨基酸)，以及成熟蛋白區(qū)(269個(gè)氨基酸)。成熟蛋白的理論相對(duì)分子質(zhì)量為30KDa左右。

2、本課題的研究對(duì)象僅包括前導(dǎo)肽和成熟區(qū)。
　　研究表明很多蛋白酶在真核生物中表達(dá)時(shí)，一些特異性的位點(diǎn)會(huì)被糖基化，這些長(zhǎng)短不一的糖鏈會(huì)影響蛋白酶的結(jié)構(gòu)和活性，影響大小與糖基化的位點(diǎn)和糖基化程度有關(guān)。本研究將野生型RML在畢赤酵母(PichiapastorisGS115)中表達(dá)，其活性為1700U/mg蛋白，是該酶在大腸桿菌中表達(dá)的6.7倍。通過(guò)Glycomod(http://web.expasy.org/glycomod/)查詢(xún)發(fā)現(xiàn)R

3、ML前導(dǎo)肽處有兩個(gè)糖基化位點(diǎn)（第8位和第58位天冬酰胺），為了探索RML在畢赤酵母中表達(dá)時(shí)前導(dǎo)肽處的糖鏈對(duì)酶結(jié)構(gòu)的影響，設(shè)計(jì)了三個(gè)去除糖基化的突變棟(M1，N8A;M2，N58A和M3，N8A和N58A)，結(jié)果證明去掉糖基化之后RML的比活是野生型的2倍，然而去掉RML前導(dǎo)肽位置處的糖基化卻不利于前導(dǎo)肽被Kex2蛋白酶切除形成成熟的蛋白，而且發(fā)現(xiàn)糖基化有助于RML分泌到胞外。
　　其次，將RML野生型(WT:WildType)和在

4、大腸桿菌中定向進(jìn)化產(chǎn)生的4株酶活依次提高的突變株(G1:L57V，G2:L57V/V67A/I111T，G3:L57V/V67A/I111T/S168P，G4:L57V/V67A/I111T/S168P/S65A)基因克隆到pPIC9K中，分別構(gòu)建了質(zhì)粒pPIC9K-WT、pPIC9K-G1、pPIC9K-G2、pPIC9K-G3、pPIC9K-G4，經(jīng)SalI線(xiàn)性化后轉(zhuǎn)入甲醇誘導(dǎo)型畢赤酵母中進(jìn)行分泌表達(dá)。與大腸桿菌宿主不同，RML的4

5、個(gè)突變株在畢赤酵母中表達(dá)時(shí)，酶活性沒(méi)有呈現(xiàn)依次提高的趨勢(shì)。研究表明RML在大腸桿菌中定向進(jìn)化的突變株不適合在真核生物中表達(dá)，這可能是因?yàn)樵松锖驼婧松锞哂胁煌牡鞍追g、修飾、折疊體系，因此原核生物定向進(jìn)化的規(guī)律不適用于真核生物。
　　然后，為了在酵母中進(jìn)行RML的定向進(jìn)化，首先利用α-factor和INU信號(hào)肽構(gòu)建了四個(gè)菌株(α-factor+WT+pESC-URA+BY4741、INU+WT+pESC-URA+BY4741

6、、α-factor+WT+pESC-URA+EBY100、INU+WT+pESC-URA+EBY100)實(shí)現(xiàn)了RML在釀酒酵母中的分泌表達(dá)。但是由于在釀酒酵母中蛋白表達(dá)量和酶活力都比較低，因此以畢赤酵母為宿主，對(duì)野生型RML進(jìn)行定向進(jìn)化，并采用羅丹明平板法進(jìn)行高通量篩選，篩選到兩個(gè)突變株8-4和8-15-1，其突變位點(diǎn)分別為R41C、A115V/D313E，均使酶活提高了25％左右。
　　最后，為了提高RML的發(fā)酵產(chǎn)量，本課題使用

7、無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基采用5L發(fā)酵罐對(duì)RML進(jìn)行表達(dá)。RML的生產(chǎn)過(guò)程分三個(gè)階段:第一階段，前40h菌體生長(zhǎng)階段，40h之后，發(fā)酵罐內(nèi)甘油消耗完全，OD600達(dá)100;第二階段，40-72h是甘油流加階段，進(jìn)一步提高菌體量，并為下一步誘導(dǎo)做準(zhǔn)備，此階段結(jié)束時(shí)OD600達(dá)320;第三階段，蛋白誘導(dǎo)階段，72h后菌體不再生長(zhǎng)，達(dá)到穩(wěn)定期，開(kāi)始進(jìn)行甲醇流加誘導(dǎo)蛋白產(chǎn)生，開(kāi)始誘導(dǎo)時(shí)甲醇流加速度為1mL/min，流加10min，2-4h之后根據(jù)需要提高甲醇