重組脂蛋白脂肪酶Q402E突變體在畢赤酵母中的表達(dá).pdf

1、脂蛋白脂肪酶(Lipoprotein lipase,LPL)是參與體內(nèi)脂質(zhì)代謝的主要成分之一,是催化血漿中甘油三酯(Triglyceride,TG)分解的關(guān)鍵酶。樹鼩是不易感動脈粥樣硬化動物。以往的研究表明樹鼩總LPL活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于人的總LPL活性,大約是人LPL活性的8倍;根據(jù)不同種屬LPL氨基酸序列比較結(jié)果,以樹鼩的序列為基準(zhǔn),對人的LPL進(jìn)行定點突變得到多種人LPL突變體,經(jīng)初步表達(dá)后發(fā)現(xiàn)Q402E突變體功能較野生型LPL明顯升高。

2、為進(jìn)一步研究樹鼩不易感動脈粥樣硬化機理,本實驗探索了脂蛋白脂肪酶Q402E突變體在畢赤酵母中的表達(dá)方法和條件,為進(jìn)一步研究LPL突變體結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系提供有效的真核表達(dá)途徑。
　　[目的]
　　構(gòu)建Q402E突變體的畢赤酵母表達(dá)載體,將構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染畢赤酵母X33菌株,通過調(diào)整誘導(dǎo)劑濃度、表達(dá)溫度、表達(dá)時間和PH值,探索 Q402E突變體在不同條件下的表達(dá)情況,為進(jìn)一步研究LPL突變體結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系提供有效的真核表達(dá)途徑。

3、
　　[方法]
　　首先,通過轉(zhuǎn)染DH5α而擴增本室凍存的ppcDNA3.1-Q402E質(zhì)粒,并以擴增產(chǎn)物為模板、以帶有XhoI、XbaI限制性酶切位點的核苷酸序列為引物,通過PCR法從ppcDNA3.1-Q402E質(zhì)粒中獲取帶有上述酶切位點的Q402E序列。經(jīng)XhoI、XbaI酶切消化畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαA和所得Q402E以獲得粘性末端,并通過瓊脂糖凝膠電泳確定酶切效果。之后,在DNAligase作用下,將Q402

4、E插入到pPICZαA中,構(gòu)建Q402E酵母表達(dá)載體并對所構(gòu)建質(zhì)粒通過內(nèi)側(cè)引物法、外側(cè)引物法和限制性內(nèi)切酶分析法進(jìn)行初步鑒定,并最終通過DNA序列測定明確Q402E成功插入到pPICZαA中并且沒有發(fā)生異常突變。經(jīng)確定后,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化通過CaCL2法制備TOP10F`感受態(tài)細(xì)胞、堿裂解法大量提取、聚乙二醇(PEG)沉淀法純化。此后,將獲得的重組質(zhì)粒經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶SacI切割后,通過電轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化并整合到酵母基因組,并先后

5、通過含有100μg/ml Zeocin?的YPD平板進(jìn)行Zeocin抗性篩選、MD、MM平板進(jìn)行Mut+即甲醇利用型篩選。篩選后,提取篩選出的菌株基因組,并以其為模板、以含有部分LPL-Q402E核苷酸序列的寡核苷酸連為引物,通過PCR方法鑒定pPICZαA-Q402E是否成功整合到畢赤酵母基因組中。對成功整合的菌株進(jìn)行復(fù)蘇和擴增,并以甲醇為誘導(dǎo)劑進(jìn)行初步表達(dá)。留取不同時間點菌液檢測蛋白表達(dá)情況和表達(dá)時間段。經(jīng)初步表達(dá)后,依次調(diào)整表達(dá)溫

6、度、誘導(dǎo)劑濃度,對比不同條件下表達(dá)情況。
　　[結(jié)果]
　　成功構(gòu)建脂蛋白脂肪酶突變體Q402E的畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαA-LPLQ402E,并證實其在畢赤酵母中可成功進(jìn)行分泌式表達(dá),且每毫升表達(dá)產(chǎn)物可在聚丙烯酰胺凝膠電泳中進(jìn)行觀察。重組蛋白在誘導(dǎo)后24小時在相應(yīng)分子量處有明顯蛋白條帶,之后條帶逐漸加重,目的蛋白表達(dá)量增加,72小時后逐漸減輕,目的蛋白量減少;降低表達(dá)溫度后,相同表達(dá)時間下目的蛋白表達(dá)無明顯增加、但雜蛋