His標簽的人白細胞介素-2突變體在巴斯德畢赤酵母中的表達及純化研究.pdf

1、白細胞介素-2(interleukin2，IL-2)是白細胞介素家庭中的重要成員之一，分子量大約為15KD。它能夠促進T淋巴細胞增殖、誘導T細胞和NK細胞產(chǎn)生TNF α，IFN γ和GM-CSF等多種細胞因子；促進B細胞分化及分泌抗體，在機體的免疫反應(yīng)中具有十分重要的調(diào)節(jié)作用，是一種重要的免疫調(diào)節(jié)核心物質(zhì)，在抗病毒、病原微生物感染及抗腫瘤等疾病治療中有著廣泛的應(yīng)用。本論文研究對象為三突變體人白細胞介素-2(編碼125位半胱氨酸→丙氨酸；

2、18位亮氨酸→蛋氨酸；19位亮氨酸→絲氨酸)，取得的主要研究結(jié)果如下： 采用PCR技術(shù)擴增出IL-2突變體基因，并在基因序列3’端引入His6，將其克隆到表達載體pPIC9K中，成功構(gòu)建真核融合表達載體pPIC9K-IL-2，電激法轉(zhuǎn)化入巴斯德畢赤酵母GS115，采用G418抗性梯度法篩選，小量表達后經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測得到高拷貝高表達工程菌株。 從發(fā)酵時間、pH值、甲醇補加量三個方面對重組基因工程菌的發(fā)酵條件

3、在搖床水平上進行了初步的優(yōu)化，獲得了一個較優(yōu)的發(fā)酵表達條件：發(fā)酵液初始pH6.0，甲醇誘導濃度為0.5％，誘導72小時；在上述條件下目的蛋白的表達量占菌體總蛋白的30％以上，目的蛋白的分泌量大約為32mg/L。對酵母工程菌進行大量表達，通過甲醇誘導分泌型表達重組的帶His-tag的MvhIL-2蛋白。經(jīng)離心、超濾濃縮后，采用Ni2+親和層析對重組蛋白純化，蛋白純度為98.6％，電泳檢測只有一條帶。實驗還利用Western-Blottin