重組載脂蛋白AI突變體的表達(dá)及抗炎作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：動脈粥樣硬化（As）是一種發(fā)生在大、中動脈的慢性炎癥性疾病。載脂蛋白A-I（apoA-I）的天然半胱氨酸突變體apoA-Imilano（A-IM）和apoA-Iparis均表現(xiàn)出增強(qiáng)的心血管保護(hù)活性，二聚體是其主要的活性形式。根據(jù)apoA-I的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和上述突變體發(fā)生突變的特殊位置，本課題組自行設(shè)計(jì)并構(gòu)建了7個apoA-I的半胱氨酸突變體。前期實(shí)驗(yàn)所誘變的半胱氨酸突變體在體外也可以不同程度的形成二聚體，本實(shí)驗(yàn)選用其中極易形成二聚體

2、的A-I（S228C）突變體進(jìn)行初步研究。 目的：原核表達(dá)并純化重組蛋白A-I（S228C）、A-IM和野生型AI(WT-AI)。以內(nèi)毒素血癥大鼠為炎癥模型，通過與WT-AI和AIM比較，重點(diǎn)觀察A-I（S228C）突變體的抗炎和抗氧化作用，探討對炎癥和多器官功能損害的保護(hù)作用及機(jī)制，以期為其抗As提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為深入理解apoA1結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。 方法：利用pET原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白A-I（S228C）

3、、A-IM和WT-AI，Ni2+親和柱進(jìn)行目的蛋白純化，經(jīng)TritonX-114和Pierce親和柱去除內(nèi)毒素，鱟試劑法檢測內(nèi)毒素合格后與大豆卵磷脂包裝形成脂質(zhì)體。采用陰莖背靜脈注射內(nèi)毒素復(fù)制內(nèi)毒素血癥大鼠模型；30只雄性Wister大鼠隨機(jī)分為六組：鹽水對照組（生理鹽水+生理鹽水，n=4）、模型組（生理鹽水+內(nèi)毒素，n=4）、磷脂對照組（大豆卵磷脂+內(nèi)毒素，n=4）、WT-AI組（WT-AI+內(nèi)毒素，n=6）、A-IM組（A-IM+內(nèi)

4、毒素，n=6）和A-I（S228C）突變體組（A-I（S228C）+內(nèi)毒素，n=6）。各組動物實(shí)驗(yàn)前及內(nèi)毒素注射后6小時(shí)，剪尾取血，分離血清，采用酶法測定血清脂質(zhì)含量，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清炎癥因子TNF-α、IL-1β, IL-6和粘附分子ICAM-1的含量，試劑盒檢測血清ALT、AST、Urea、Cre和CK等反映肝腎肌組織功能指標(biāo)的含量，MDA、NO和T-AOC試劑盒測定血清脂質(zhì)過氧化程度及總抗氧化能力。將大鼠固定，

5、PBS灌流，取心、肝、脾、肺、腎組織置于10％中性福爾馬林中固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，HE染色，光鏡觀察組織病理結(jié)構(gòu)改變、白細(xì)胞浸潤等。 結(jié)果：重組蛋白A-I（S228C）、A-IM和WT-AI表達(dá)量超過10mg/L菌液，經(jīng)Ni2+親和柱純化及TritonX-114和Pierce親和柱去除內(nèi)毒素后，純度達(dá)到90％，內(nèi)毒素含量達(dá)到注射標(biāo)準(zhǔn)。內(nèi)毒素血癥模型大鼠出現(xiàn)炎癥表型。A-I（S228C）突變體組與模型組相比，大鼠血清炎癥因子T

6、NF-α、IL-1β、IL-6和粘附分子ICAM-1含量（P<0.01）以及血清ALT、AST、Urea、Cre和CK水平顯著降低（均為P<0.05）；血清MDA和NO含量顯著降低（分別為：P<0.01和P<0.05）；機(jī)體總抗氧化能力顯著增加（P<0.01）；光鏡觀察肺組織病理結(jié)構(gòu)改變和白細(xì)胞浸潤得到明顯改善。 結(jié)論： 1、獲得大量高純度的WT-AI及A-IM、A-I(S228C)突變體蛋白。 2、成功復(fù)制

7、內(nèi)毒素血癥大鼠模型。 3、重組蛋白A-I（S228C）能降低大鼠血清炎癥因子及粘附分子水平。 4、重組蛋白A-I（S228C）能增強(qiáng)大鼠機(jī)體的總抗氧化能力，并抑制血清脂質(zhì)過氧化。 5、重組蛋白A-I（S228C）能降低大鼠血清肝、腎、肌功能指標(biāo)含量，改善肺組織病理結(jié)構(gòu)改變及白細(xì)胞浸潤，提示對大鼠肝臟、腎臟、肺臟、骨骼肌和心肌等多種組織器官具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用機(jī)制可能與其抗炎和抗氧化作用有關(guān)。 6