重組葡激酶突變體生產(chǎn)工藝及質(zhì)量研究.pdf

1、血栓性疾病是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的疾病之一.目前的溶栓劑鏈激酶、尿激酶及其突變體等存在再通不完全、血栓再形成、出血和過(guò)敏反應(yīng)等缺陷.葡激酶(Staphylokinase,SAK)具有與組織型纖溶酶原激活劑相當(dāng)?shù)娜芩ɑ钚?并有更高的纖維蛋白專(zhuān)一性,是很有應(yīng)用前景的溶栓劑.為降低野生型Sak的免疫原性,采用重組改構(gòu)葡激酶突變質(zhì)粒,將其在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá). 本研究將已構(gòu)建的DH5 α/pBV220/rSAK工程菌株生產(chǎn)工藝探索,從常用培

2、養(yǎng)基中篩選出最適合發(fā)酵和rSAK表達(dá)的M9培養(yǎng)基,采用單因子實(shí)驗(yàn)方法對(duì)M9培養(yǎng)基中的碳源和氮源進(jìn)行了逐個(gè)篩選,確定碳源為葡萄糖,氮源為蛋白胨和酵母粉,設(shè)計(jì)正交試驗(yàn),對(duì)培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化,確定出較適合的培養(yǎng)基,同時(shí)在培養(yǎng)基中添加Mg<'2+>以加速菌體的生長(zhǎng). 搖瓶發(fā)酵工藝研究中系統(tǒng)地考察了培養(yǎng)溫度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)維持時(shí)間對(duì)菌體生長(zhǎng)和rSAK表達(dá)的影響,也對(duì)發(fā)酵液初始pH值、溶氧、種子菌齡、接種量等工藝條件進(jìn)行了研究,選擇出最佳的

3、搖瓶培養(yǎng)條件:菌種30℃進(jìn)行培養(yǎng),發(fā)酵液初始pH值為7.2-7.4,搖床轉(zhuǎn)速180r/min左右,在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期升溫至42℃誘導(dǎo)表達(dá)3h,然后轉(zhuǎn)入35℃再培養(yǎng),可獲得較高的菌體產(chǎn)量和rSAK的表達(dá)量.此時(shí)rSAK表達(dá)量為24.6﹪,產(chǎn)量是0.276g/L.另外,深層發(fā)酵特性研究表明搖瓶中溶氧不足是限制菌體生長(zhǎng)和rSAK表達(dá)的主要原因. 發(fā)酵罐間歇培養(yǎng)研究,確定出最優(yōu)培養(yǎng)條件為:通過(guò)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌速度控制溶氧大于50,采用10﹪

4、-15﹪的接種量,在A<,600>達(dá)2.0時(shí)誘導(dǎo)可獲得最高的rSAK產(chǎn)量,達(dá)到0.626g/L,是搖瓶中產(chǎn)量的2.3倍.深層發(fā)酵特性研究,發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)培養(yǎng)液中仍含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),推測(cè)如果采用分批補(bǔ)料培養(yǎng)可以進(jìn)一步提高rSAK產(chǎn)量. 純化制備的蛋白按照《中國(guó)生物制品規(guī)程》相關(guān)原則進(jìn)行質(zhì)量研究,其中純度≥95.0﹪、殘余菌體蛋白殘留量≤0.05﹪、內(nèi)毒素含量<10EU/mg等,制備出符合藥物臨床前評(píng)價(jià)所需的rSAK改構(gòu)蛋白.體