人sBLyS突變體的構(gòu)建及功能研究.pdf

1、B淋巴細胞刺激因子(Blymphocytestimulator，BLyS)，是腫瘤壞死因子(TNF)超家族的成員。人BLyS全長285個氨基酸，為Ⅱ型跨膜蛋白，有膜結(jié)合型和可溶性兩種形式，其發(fā)揮功能的主要區(qū)域為134-285位氨基酸殘基(sBLyS)，其受體TACI、BCMA和BAFF-R主要表達于B淋巴細胞。作為B淋巴細胞的共刺激因子，BLyS通過與B淋巴細胞表面受體結(jié)合而誘導其增殖、分化和免疫球蛋白產(chǎn)生，在體液免疫中發(fā)揮著重要作用。

2、研究表明，BLyS表達缺陷將導致過渡B細胞缺失，外周B細胞顯著減少，無法產(chǎn)生正常的體液免疫反應；其過表達將導致B細胞嚴重增多，是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosus，SLE)、類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis，RA)、干燥綜合征(Sj(o)gren'ssyndrom，SS)等自身免疫性疾病的病因之一，其血清濃度往往與病情的嚴重程度存在一定的正相關(guān)。因此，一方面可通過增強BLyS的活性來

3、增強其刺激B細胞增殖及免疫球蛋白的產(chǎn)生，可能對治療免疫缺陷疾病發(fā)揮作用；另一方面可設(shè)法抑制BLyS的功能，以此作為治療自身免疫性疾病的候選策略。 為此我們克隆了人sBLyScDNA的突變體(s△BLyS、sBLyS-G、sBLyS-S)，并對其進行原核表達、純化及功能研究，同時還構(gòu)建了sBLyS及其突變體的酵母表達載體，為探討sBLyS的作用機制及其與相關(guān)疾病的關(guān)系創(chuàng)造條件。并取得了如下結(jié)果： 1.以pUC19/sBLy

4、S為模板，經(jīng)一步反向PCR致突變法成功擴增了缺失編碼第142～160氨基酸殘基的cDNA序列、以編碼甘氨酸的GGG替換第146位半胱氨酸TGC的cDNA序列、以編碼絲氨酸的TCC替換第146位半胱氨酸TGC的cDNA序列，分別命名為pUC19/s△BLyS、pUC19/sBLyS-G和pUC19/sBLyS-S。經(jīng)測序后與GenBank比對，與實驗設(shè)計的序列完全一致。 2.將上述測序正確的目的片段分別連接于原核表達載體pQE-8

5、0L，成功地構(gòu)建了重組原核表達質(zhì)粒pQE-80L/s△BLyS、pQE-80L/sBLyS-G和pQE-80L/sBLyS-S。 3.將上述質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)IPTG誘導，均獲得了較高水平的表達，并確立了這些突變體在大腸桿菌中高效表達的優(yōu)化條件為：pQE-80L/s△BLyS終濃度為0.5mmol/L、pQE-80/sBLyS-G和pQE-80L/sBLyS-S終濃度為1mmol/L的IPTG在37℃誘導表達4h。

6、SDS-PAGE分析可見，各重組蛋白的相對分子量大小依次約為18×103、20×103和20×103，主要以包涵體的形式表達。Westernblotting分析顯示，各目的蛋白均在相應標準分子量處呈現(xiàn)單一條帶。 4.經(jīng)Ni2+-NTA系統(tǒng)純化及尿素透析，各重組蛋白得到了有效純化和復性。純化蛋白在SDS-PAGE上呈現(xiàn)單一條帶。復性蛋白經(jīng)SephadexG75柱層析顯示，以單體和三聚體兩種形式存在。 5.功能研究結(jié)果表明，

7、本實驗所制備的重組蛋白s△BLyS能抑制人外周血淋巴細胞和Raji細胞的增殖；制備的重組蛋白sBLyS-G、sBLyS-S不僅可刺激人外周血淋巴細胞和Raji細胞的增殖，而且能抑制腫瘤細胞U937的生長。其中sBLyS-S的促進淋巴細胞增殖功能和對腫瘤細胞U937的殺傷功能比野生型sBLyS更強。 6.以pUC19/sBLyS及其突變體(pUC19/s△BLyS、pUC19/sBLyS-G和pUC19/sBLyS-S)為模板，經(jīng)