尿激酶原突變體的分子設(shè)計(jì)、重組表達(dá)與性質(zhì)鑒定.pdf

1、在利用生物信息學(xué)的方法分析尿激酶原突變體GZ5-sPA-his結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的基礎(chǔ)上，通過拼接PCR的方法構(gòu)建了缺失C端肽段SHFLPWIRSHTKEENGLAL編碼序列且突變了Lys<'156>→His、Gli<'157>→Ala．的新尿激酶原突變體基因gz5-spa-m2-his，并將其克隆入表達(dá)載體pET21b。該突變體在大腸桿菌菌株BL21(DE3)中獲得高效表達(dá)，并以包涵體形式存在，表達(dá)量約占總蛋白的30％。包涵體經(jīng)洗滌、變性

2、后，利用Ni<'2+> chelating sepharose金屬螯合層析分子篩進(jìn)行柱上復(fù)性，成功獲得了可在低溫下穩(wěn)定保存的可溶性目標(biāo)蛋白GZ5-sPA-M2-his，純度在90％以上。以S-2444為底物的酰胺解活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，缺失肽段SHFLPWIRSHTKEENGLAL后的GZ5-sPA-M2-his仍具有尿激酶原的生物活性。 同時(shí)，在GZ5-sPA-M2-his的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了N端缺失GPRPSGGAGSLKFQCG

3、QGGGGSRGDSGG．AGS肽段，C端缺失LTGIVSWGRGCALKDKPGVYTRVSHFLPWIRSHT KEENGLAL，同時(shí)點(diǎn)突變Cys<'73>→Ser、Cys<'220>→Ser的尿激酶原突變體scu-PAm，將其克隆入大腸桿菌菌株BL21(DE3)中獲得高效表達(dá)，30℃以下時(shí)同時(shí)以可溶表達(dá)與包涵體形式表達(dá)，超聲波破碎細(xì)胞后將可溶蛋白與尿激酶的發(fā)色底物S-2444進(jìn)行酰胺解活性反應(yīng)，能夠引起S-2444的顏色反應(yīng)，表明

4、所獲可溶表達(dá)目的蛋白具有一定的生物活性。 另外，根據(jù)原核生物中多順反子的基因表達(dá)原理，以表達(dá)載體pET21b和 pMAL-C<,2>X為基礎(chǔ)，通過構(gòu)建共表達(dá)載體pET21b-gz5-spa-his-mbp，在大腸桿菌菌株 BL21(DE3)胞內(nèi)共表達(dá)尿激酶原突變體GZ5-sPA-his和融合伴體：MBP(maltose binding protein,麥芽糖結(jié)合蛋白)，期望利用后者可幫助蛋白折疊的功能，達(dá)到在大腸桿菌胞內(nèi)獲得可溶