N-端引入RGD序列的葡激酶突變體的構建、表達、純化及性質研究.pdf

1、血栓性疾病特別是腦血栓、心肌梗塞、深度靜脈血栓等均有較高的致死、致殘率，溶栓治療法是治療此類疾病的常規(guī)療法。自從二十世紀八十年代以來，已先后開發(fā)了多種溶栓制劑，現(xiàn)已被廣泛應用于臨床，例如：重組組織型纖溶酶原(recombinant tissue-typeplasminogen activator，rt-PA)、尿激酶(UK)、重組鏈激酶(recombinant streptokinase，r-SK)等，這些溶栓制劑各有優(yōu)缺點，其中以rt

2、-PA療效最佳，但因其價格昂貴使用范圍受到很大限制。科研工作者正在努力尋找一種既有較好溶栓療效價格又便宜的新一代溶栓制劑。 天然葡激酶(staphylokinase，SAK)是金黃色葡萄球菌溶原性噬菌體合成的一種蛋白質。臨床研究表明，重組葡激酶(r-SAK)具有與rt-PA相當?shù)娜芩ɑ钚?，且有更高的纖維蛋白專一性，除此之外，它能在大腸桿菌中高效表達，生產成本低，是一種很有應用前景的溶栓制劑。但臨床試驗表明，使用r-SAK后仍有一

3、定的再梗塞率，而活化后血小板聚集反應是成功溶栓后再栓塞的主要原因，因此在溶栓的同時進行抗凝、抗血小板聚集治療是一種積極的預防再栓塞的治療策略。GPIIb/IIIa拮抗劑能與纖維蛋白原競爭性結合血小板表面的GPIIb/IIIa受體，能夠抑制血小板聚集通路的最后一步，具有很強的抑制血小板聚集的作用。國內外根據(jù)RGD(Arg-Gly-Asp)序列已設計了許多GPIIb/IIIa受體阻斷劑，用于抑制血小板聚集。 為研制兼具溶栓和防栓功能

4、的新型溶栓劑，降低溶栓后再栓塞的發(fā)生率，本試驗設計在SAK分子的N-端引入RGD序列，構建四個新型雙功能SAK突變體分子，研究其表達和純化，并分析其生物學活性。 本實驗采用PCR介導的定點突變的方法，通過設計N-端包含RGD短肽序列的突變引物，以野生型葡激酶(wild type staphylokinase，WT-SAK)質粒為模板，PCR克隆得到SAK突變體基因；將突變后的SAK基因序列與表達載體pBV220質粒連接后，轉化大

5、腸桿菌BL2l進行表達：應用陽離子交換層析、凝膠過濾層析和陰離子交換層析連續(xù)三步層析法純化表達產物，并對所得純化產物進行生物學活性鑒定。實驗結果顯示，SAK突變體蛋白在大腸桿菌BL2l中的表達量占菌體蛋白總量的50％以上；三步連續(xù)層析純化后其純度可達97％以上；測得其纖溶比活性分別為10.8×104mJ/mg、10.1×104HU/mg、11.0×104HU/mg、11.2×104HU/mg，不低于WT-SAK的纖溶活性(9.8×104

6、HU/mg)；并且具有明顯的抗血小板聚集活性，實驗測得血小板聚集抑制率分別為10.72％、12.36％、19.71％、21.65％，明顯高于WT-SAK(3.98％)；ELISA分析結果表明，SAK突變體中大腸桿菌菌體蛋白殘留量均小于0.1％，符合《中國藥典》2005版中規(guī)定的要求。本實驗中，突變體基因在大腸桿菌中獲得高效表達，得到了高純度、高活性的SAK突變體蛋白。突變體既保留了野生型葡激酶的纖溶活性，同時又具有了抗血小板聚集功能，為