八肋游仆蟲(chóng)中心蛋白N端及其突變體的金屬結(jié)合性質(zhì).pdf

1、中心蛋白是一種分子量約為20 kD的酸性蛋白，屬于高度保守的鈣調(diào)蛋白EF-hand超家族，廣泛存在于多種生物體，如酵母、藻類(lèi)、原生動(dòng)物、高等植物和哺乳動(dòng)物等的中心體（基體或紡錘極體）中，參與中心體的復(fù)制與分離、纖維的收縮和鞭毛切除等過(guò)程。
　　八肋游仆蟲(chóng)中心蛋白(EoCen)由兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的區(qū)域（N端和C端）組成，每端包含兩個(gè)EF-手結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)鈣離子結(jié)合位點(diǎn)。為了研究八肋游仆蟲(chóng)中心蛋白N端loop區(qū)首個(gè)氨基酸的生物功能，我們通過(guò)

2、分子生物學(xué)方法構(gòu)建了N端半分子的突變體N-D37K和N-D73K(D是天冬氨酸，K是賴(lài)氨酸)。
　　首先利用PCR技術(shù)，在全分子突變體D37K的基礎(chǔ)上通過(guò)截短構(gòu)建得到了N端突變體N-D37K，然后通過(guò)定點(diǎn)突變的方法構(gòu)建得到了另一個(gè)N端突變體N-D73K。DNA序列測(cè)定表明所得突變體只有目的位點(diǎn)的基因發(fā)生突變，而無(wú)其他任何位點(diǎn)的隨機(jī)突變。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，在誘導(dǎo)劑IPTG的誘導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)目的蛋白的可溶性表達(dá)。融

3、合蛋白通過(guò)PPase酶切和GST親和層析后得到純的目的蛋白。同時(shí)將野生型蛋白(EoCen)和課題組之前構(gòu)建完成的N端野生型蛋白(N-EoCen)誘導(dǎo)表達(dá)純化得到目的蛋白。經(jīng)SDS-PAGE分析顯示，所得蛋白均不含雜蛋白條帶，達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需的純度。
　　本文運(yùn)用熒光、電泳和電化學(xué)等方法研究了中心蛋白N端及其突變體與金屬離子(Ca2+/Tb3+)的結(jié)合性質(zhì)。鋱離子熒光敏化實(shí)驗(yàn)和共振光散射實(shí)驗(yàn)證明，N-D73K可以結(jié)合兩個(gè)Tb3+，這與N

4、端野生型N-EoCen一致，而N-D37K只能結(jié)合一個(gè)Tb3+。同時(shí)，我們得到了Tb3+與中心蛋白Ⅱ部位的結(jié)合常數(shù)KⅡ-Tb=(8.31±0.18)×104 M-1。通過(guò)Ca2+與Tb3+競(jìng)爭(zhēng)N-D37K的結(jié)合位點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)，我們得到了Ca2+與中心蛋白Ⅱ部位之間的結(jié)合常數(shù)KⅡ-Ca=(0.94±0.12)×102 M-1。用TNS作為疏水探針，我們研究了中心蛋白N端及其突變體結(jié)合金屬離子后的構(gòu)象變化，與N-EoCen、N-D73K相比，N

5、-D37K的構(gòu)象幾乎不發(fā)生變化，同時(shí)得到了TNS與Tb3+飽和的N-EoCen和N-D37K的結(jié)合常數(shù)，K(Tb3+-N-D37K-TNS)=(6.57±0.89)×106 M-1和K(Tb3+-N-EoCen-TNS)=(9.35±0.05)×105 M-1。通過(guò)共振光散射實(shí)驗(yàn)和化學(xué)交聯(lián)實(shí)驗(yàn)，我們對(duì)N-EoCen、N-D73K、N-D37K的聚集性質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn):與N-EoCen、N-D73K相比，N-D37K幾乎不聚集。另外，我們還對(duì)