八肋游仆蟲cDNA文庫構建及肽鏈釋放因子互作蛋白的初步篩選.pdf

1、蛋白質合成過程是一個開放的系統(tǒng)，其中多種因子與細胞內蛋白質相互作用調節(jié)蛋白質的合成過程，維持細胞內所有生命過程的有序進行，同時細胞內有一系列蛋白質包括一些酶參與蛋白質合成的調節(jié)，形成了復雜的mRNA代謝和蛋白質合成的網(wǎng)絡和信號轉導途徑。酵母雙雜交文庫是篩選與目的蛋白質相互作用蛋白質的一種非常有效的方法。利用該方法已經(jīng)篩選得到了許多相互作用的目的蛋白質，為研究細胞內的蛋白質相互作用網(wǎng)絡和信號轉導途徑提供了極為有效的工具。
　　蛋白質

2、的合成過程包括核糖體上肽鏈合成的起始、延伸和新生肽鏈的釋放。肽鏈釋放因子不僅在細胞內蛋白質合成終止過程中起作用，而且在其它方面也起到重要作用，表現(xiàn)出多功能蛋白質的特征。
　　原生動物八肋游仆蟲是一類單細胞真核生物，其密碼子使用存在特殊性:終止密碼子UGA在該生物體中編碼半胱氨酸。據(jù)相關文獻報道纖毛蟲中八肋游仆蟲的閱讀框中終止密碼子(UGA)出現(xiàn)的頻率最低，其mRNA最有效的被翻譯成了高分子量的連續(xù)的多肽鏈，這一結果為首次纖毛蟲酵母

3、雙雜交文庫的構建提供了重要依據(jù)。
　　本研究以八肋游仆蟲為材料，提取總RNA，用mRNA反轉錄得到的cDNA構建酵母雙雜交文庫，用蛋白質合成終止過程中負責新生肽鏈釋放的兩類肽鏈釋放因子作為誘餌蛋白，篩選與其相互作用的蛋白質，獲得了以下主要結果:
　　提取了八肋游仆蟲總RNA，瓊脂糖凝膠電泳中28S rRNA條帶顯示得到了較為理想的提取物;利用clontech公司的BD MatchmakerTM Library Contruc

4、tion&Screening kit試劑盒，將得到的總RNA中的mRNA利用兩步法合成ds cDNA，通過純化、富集、再純化得到了與對照相比豐度比較適合的cDNA;用PCR方法對得到的cDNA進行了鑒定，結果擴增到已知的基因。將得到的cDNA與用SmaⅠ單酶切處理的文庫質粒pGADT7-Rec混合，轉化接合酵母菌AH109，涂板培養(yǎng)，收集克隆;最后分析文庫滴度為2.437×107cfu/mL，文庫構建基本完成，隨后隨機提取文庫中的質粒，

5、用質粒pGADT7-Rec上的測序引物進行測序分析，證明在質粒中重組了八肋游仆蟲的基因片段。
　　以蛋白質合成終止過程中的兩類肽鏈釋放因子之一eRF3作為誘餌蛋白基因，利用酵母雙雜交的方法從游仆蟲cDNA文庫中篩選與誘餌蛋白基因相互作用的蛋白基因。獲得以下結果:1）構建了含誘餌蛋白基因的重組質粒pGBKT7-eRF3，將其轉化到接合菌Y187中，對Y187/pGBKT7-eRF3菌株進行了鑒定，提取質粒轉化大腸桿菌，進行擴增，將得

6、到的質粒進行分析和測序，結果表明成功構建了含有融合誘餌蛋白重組基因的目的菌株;2）文庫菌和誘餌菌雜交，接合率大于2％;將接合后的菌液涂于SD/-Leu/-Trp/-His平板上進行初級篩選，獲得了200個陽性克隆;再將初級篩選得到的克隆涂于SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade平板上進行嚴謹性篩選，獲得了36個克隆;重復嚴謹性篩選后得到22個克隆;最后用β-半乳糖苷酶活性進行鑒定，獲得16個陽性克隆，一系列的篩選總率為8％。3）將

7、篩選出的陽性菌落提取質粒后轉化大腸桿菌DH5α，用獲得的高拷貝質粒進行PCR和酶切鑒定。測序結果表明，16個質粒中6號和74號質粒含有較長的未知基因閱讀框核酸序列;BLAST比對結果顯示33號和105號與游仆蟲核糖體RNA的序列類似;其余測序結果與這四個序列基本相同。4）酵母雙雜交重復鑒定實驗表明6號是陽性結果，說明其編碼的蛋白質在體內與誘餌蛋白eRF3相互作用;74號結果呈陰性，需要再做體外實驗進一步確認。5）根據(jù)6號質粒的測序結果設