蠕形螨cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及初步分析.pdf

1、目的：蠕形螨俗稱毛囊蟲(chóng)(follicle mite)，它們?cè)诜诸惿蠈儆谡骝?，蠕形螨?Demodicidae)，永久性寄生于人和哺乳動(dòng)物的毛囊和皮脂腺內(nèi)。能寄生于人體的蠕形螨包括兩個(gè)種，即毛囊蠕形螨(Demodex folliculorum Simon，1842)和皮脂蠕形螨(Demodex brevis Akbulatova，1963)，分別寄生在人的毛囊和皮脂腺內(nèi)。人體蠕形螨病是最常見(jiàn)的皮膚病之一，近年隨著人們對(duì)美容要求的提高，蠕

2、形螨病的預(yù)防和治療問(wèn)題，受到專業(yè)人士和民眾的關(guān)注，但是，目前對(duì)蠕形螨的基礎(chǔ)理論研究尚處在低水平，分子生物學(xué)研究才剛剛起步。cDNA文庫(kù)是研究及鑒定生物的未知功能基因的一種很有效的手段，蠕形螨cDNA文庫(kù)的構(gòu)建為今后利用文庫(kù)篩選蠕形螨的未知功能性基因序列及進(jìn)一步探究該基因的功能等方面的分子生物實(shí)驗(yàn)研究做好鋪墊。山羊蠕形螨cDNA文庫(kù)的構(gòu)建也為人體蠕形螨的cDNA文庫(kù)的構(gòu)建的探索提供方法依據(jù)和技術(shù)支持，為進(jìn)一步探索其分子致病機(jī)理打下基礎(chǔ)。<

3、br>　　 方法：采用自然沉降法收集山羊蠕形螨樣本。從濟(jì)南市天橋區(qū)桑梓店鎮(zhèn)山羊養(yǎng)殖場(chǎng)獲取新鮮的波爾山羊皮，用手術(shù)刀從內(nèi)側(cè)面剖開(kāi)皮膚結(jié)節(jié)，從中取得干酪樣物。在解剖顯微鏡直視下，用自制挑螨針清洗分離蠕形螨個(gè)體，將螨挑入另一張滴有清洗液的凹玻片上，反復(fù)兩次，在將螨跳入無(wú)菌雙蒸中清洗，反復(fù)兩次。將洗凈的足量的螨置于自制的消毒微型研缽中，保持低溫下研磨。將蠕形螨勻漿移入EP管中，用TransZol Up試劑盒提取山羊蠕形螨的總RNA，經(jīng)凝膠電泳

4、檢測(cè)總RNA的完整性。參照試劑使用說(shuō)明書(shū)，以RNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成第1鏈eDNA，再通過(guò)LD-PCR獲得第2鏈cDNA。為提高文庫(kù)質(zhì)量，用凝膠回收法將小于500bp的片段去除來(lái)純化雙鏈cDNA。將大于500bp的cDNA片段與pGM-T載體連接，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞構(gòu)建蠕形螨的cDNA文庫(kù)，最后對(duì)文庫(kù)進(jìn)行鑒定及分析。
　　 結(jié)果：采集到了足量的蠕形螨樣本，成功提取了高質(zhì)量的山羊蠕形螨總RNA，經(jīng)檢驗(yàn)

5、總RNA結(jié)構(gòu)完整且無(wú)明顯降解，能滿足構(gòu)建cDNA文庫(kù)的需要。獲得的雙鏈cDNA，經(jīng)電泳檢測(cè)顯示，呈彌散的帶狀，集中在200～3000bp，符合真核生物mRNA分布規(guī)律，表明合成的雙鏈cDNA質(zhì)量較好，較為完整。去除小于500bp的片段，純化后的cDNA片段與pGM-T載體連接，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TOP10建成了蠕形螨cDNA文庫(kù)，經(jīng)鑒定cDNA文庫(kù)的重組效率達(dá)98％，庫(kù)容量為2.56×106cfu，插入片段平均長(zhǎng)度大于10

6、00bp，達(dá)到構(gòu)建cDNA文庫(kù)的要求。
　　 結(jié)論：本次實(shí)驗(yàn)研究成功的提取了蠕形螨的總RNA，并構(gòu)建了山羊蠕形螨cDNA文庫(kù)。cDNA文庫(kù)是研究及鑒定生物的未知功能基因的一種很有效的手段，蠕形螨cDNA文庫(kù)的構(gòu)建為今后利用文庫(kù)篩選蠕形螨的未知功能性基因序列及進(jìn)一步探究該基因的功能等方面的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究做好了鋪墊。山羊蠕形螨cDNA文庫(kù)的構(gòu)建也為將來(lái)人體蠕形螨的cDNA文庫(kù)的構(gòu)建提供了方法依據(jù)和技術(shù)支持，為進(jìn)一步探索人體蠕形螨