柑桔葉片干旱脅迫抑制差減cDNA文庫(kù)的構(gòu)建與初步分析.pdf

1、在各種自然災(zāi)害中，旱災(zāi)居于首位。在世界范圍內(nèi)，干旱缺水對(duì)農(nóng)業(yè)和社會(huì)造成的損失相當(dāng)于其他自然災(zāi)害之和。柑桔是世界上產(chǎn)量最大的水果，干旱是柑桔增產(chǎn)的主要限制因子之一。利用分子生物學(xué)方法研究柑桔在水分脅迫條件下的應(yīng)答機(jī)制，進(jìn)而研究其抗旱機(jī)理，對(duì)于全面認(rèn)識(shí)抗旱性的遺傳基礎(chǔ)，培育抗旱新品種，研發(fā)抗旱栽培技術(shù)，具有重要意義。 本研究以柑桔椪柑(Citrus．reticulata)為實(shí)驗(yàn)材料，構(gòu)建干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)基因的抑制差減雜交(Suppr

2、ession Subtractive Hybridization，SSH)cDNA文庫(kù)，通過(guò)對(duì)文庫(kù)的篩選、克隆測(cè)序和功能分析，了解柑桔干旱應(yīng)答機(jī)制，為發(fā)掘和利用抗旱相關(guān)基因奠定基礎(chǔ)。 用盆栽興春椪柑自然干旱脅迫作為處理組(Tester)，正常澆水作為對(duì)照組(Drivet)，用本實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)的苯酚/氯仿/SDS法分別提取上述兩種材料的總RNA，分離純化，獲得高質(zhì)量mRNA各約4μg。采用SSH試劑盒法進(jìn)行抑制差減雜交，首先將上述兩種

3、材料mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA，然后進(jìn)行Rsal酶切，之后將Tester酶切產(chǎn)物分成2份：1份與Adoptorl連接，另1份與Adoptor2R連接，最后進(jìn)行抑制差減雜交；將抑制差減雜交第二次PCR的產(chǎn)物純化后連接至pTZ57R/T載體中，轉(zhuǎn)化到DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選、培養(yǎng)，獲得具有438個(gè)重組克隆的SSH文庫(kù)。 將克隆進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，得到陽(yáng)性克隆386個(gè)。隨機(jī)送樣測(cè)序85個(gè)，獲得質(zhì)量較好EST序列78條，

4、其中不重復(fù)EST 62條，序列同源性比較結(jié)果為90％以上的EST可以在GenBank里找到同源性較高的cDNA，其中80％以上的cDNA源于植物在病原菌誘導(dǎo)、干旱、水分、熱擊、冷害、鹽害等生物或非生物脅迫下特異表達(dá)的cDNA文庫(kù)。在可以找到同源性的EST中，有的在好幾個(gè)文庫(kù)中出現(xiàn)，這說(shuō)明植物所受的各種逆境脅迫都直接或間接影響植物體的水分代謝，各種抗逆反應(yīng)可能存在某些共同的機(jī)制。功能比較分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)有已知功能的EST 51條，根據(jù)這些ES

5、T所代表的基因的功能可分為8類：代謝、轉(zhuǎn)錄、防御、光合作用、蛋白合成、信號(hào)傳導(dǎo)、能量、未知功能。其中有28個(gè)基因與干旱脅迫關(guān)系密切，對(duì)它們進(jìn)行了分析討論。柑桔的干旱脅迫應(yīng)答過(guò)程涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因的表達(dá)調(diào)控、物質(zhì)的合成、防御反應(yīng)、、活性氧清除和保護(hù)光合系統(tǒng)等多種途徑。獲得與抗干旱脅迫密切相關(guān)的鈣依賴蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子，脫水素DHN6，、超氧化物歧化酶、NADP--蘋(píng)果酸酶、熱擊蛋白、肌醇-1-磷酸合成酶等重要基因的EST。這些EST基本上