草魚cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及CC趨化因子基因的特征分析.pdf

1、CC趨化因子（CC Chemokine）是一類能夠促進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)炎癥部位的各種白細(xì)胞的補(bǔ)充、激活和黏附的趨化性細(xì)胞因子家族，是魚類天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分。趨化因子也是當(dāng)今國(guó)際魚類分子免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。趨化因子的研究將有助于更好地了解魚類抗病性與天然免疫性的關(guān)系。 本文以草魚為研究對(duì)象，通過(guò)構(gòu)建草魚cDNA文庫(kù)，在草魚腸道和鰓cDNA文庫(kù)中篩選到2個(gè)草魚CC趨化因子基因，將其命名為CCL24和CCL5，并對(duì)這兩個(gè)基因在草魚各

2、組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，為了解草魚的先天免疫系統(tǒng)奠定了一定的基礎(chǔ)。 采用飽和雜交法成功構(gòu)建了草魚腸道、鰓和肝胰臟的均一化cDNA文庫(kù)。隨機(jī)測(cè)序得到7374個(gè)EST序列，去除插入片段小于100bp和空載體得到6370個(gè)序列。4964個(gè)非重復(fù)的基因序列中，2781個(gè)為GenBank已知的基因序列，2183個(gè)是未知的新基因序列。2781個(gè)已知基因序列中，沒(méi)有冗余的有2105個(gè)，占基因總數(shù)的74．69％，2～5倍冗余的有646個(gè)基因，

3、約占總數(shù)的23．23％，大于5倍冗余的基因數(shù)目為30個(gè)，占總數(shù)的1．08％。4964個(gè)不同基因中551個(gè)存在微衛(wèi)星序列，261個(gè)為已知基因序列，290個(gè)為未知的新基因序列。這些研究結(jié)果，為積累草魚遺傳方面的基礎(chǔ)信息，了解草魚腸道、鰓和肝胰臟組織的基因表達(dá)提供了較好的研究基礎(chǔ)。 在草魚腸道和鰓的cDNA文庫(kù)中各篩選到一個(gè)CC趨化因子基因，GenBank比對(duì)結(jié)果顯示，腸道中篩選的與斑馬魚CCL24基因相似性最高（76％），將其命名為

4、草魚CC趨化因子CCL24；鰓中篩選的與斑馬魚CCL5基因相似性最高（77％），將其命名為草魚CC趨化因子CCL5。草魚CCL24基因cDNA全長(zhǎng)為1059bp，編碼95個(gè)氨基酸；草魚CCL5基因cDNA全長(zhǎng)為895bp，編碼119個(gè)氨基酸。用生物信息學(xué)的方法分別對(duì)上述的2個(gè)CC趨化因子基因分析。CCL24蛋白分子量為10370．399Da，等電點(diǎn)為8．39； CCL5分子量為13320．981Da，等電點(diǎn)為9．155。CCL24和CC

5、L5在氨基端都存在大量的疏水性殘基，而羧基末端則有較多的親水性殘基，二者的抗原決定簇分析結(jié)果顯示CCL24與CCL5均具有很強(qiáng)的抗原性。CCL24和CCL5在2個(gè)相鄰的半胱氨酸殘基之前均具信號(hào)肽，CCL24最大可能的信號(hào)肽剪切位點(diǎn)位于第22位與第23位氨基酸殘基之間（TDA-VA），CCL5最大可能的信號(hào)肽剪切位點(diǎn)位于第27位與第28位氨基酸殘基之間（AEA-QA）。CCL24與CCL5均具膜內(nèi)側(cè)向膜外側(cè)和膜外側(cè)向膜內(nèi)側(cè)的跨膜結(jié)構(gòu)各一個(gè)

6、。CCL5具有典型的Small cytokines（intercrine/chemokine）C-C subfamily結(jié)構(gòu)域。CCL24和CCL5編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)均以α螺旋和隨機(jī)卷曲為主，間或有β轉(zhuǎn)角。通過(guò)分析CCL24和CCL5與斑點(diǎn)叉尾鮰CC趨化因子家族進(jìn)化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CCL24與SCYA112同源性最高，CCL5與SCYA106同源性最高。 利用半定量RT-PCR檢測(cè)CCL24和CCL5在草魚精巢、頭腎、腎臟、肝胰臟、腸道

7、、肌肉和皮膚等不同組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CCL24基因僅在腎臟和腸道中有表達(dá)，且腎臟的表達(dá)量要高于腸道；CCL5在草魚精巢、頭腎、腎臟、肝胰臟、腸道、肌肉、皮膚等組織均有表達(dá)，腎臟的表達(dá)最高，頭腎次之，在肝胰臟和精巢中的表達(dá)量最低。 草魚CC趨化因子基因CCL24存在可變剪接現(xiàn)象。CCL24基因開(kāi)放閱讀框由四個(gè)外顯子和三個(gè)內(nèi)含子組成，正常剪接的轉(zhuǎn)錄本編碼95個(gè)氨基酸的CC趨化因子，而另一個(gè)轉(zhuǎn)錄本保留了第一個(gè)內(nèi)含予，導(dǎo)致密碼子移位，終