重組游仆蟲核糖體蛋白L11與肽鏈釋放因子體外相互作用的分析.pdf

1、蛋白質合成是細胞內(nèi)最重要的生命活動之一，這一過程包括核糖體上新生肽鏈合成的起始、延伸和終止。核糖體蛋白L11(ribosome protein L11)是一種高度保守的蛋白質，是蛋白質合成過程中的幾個步驟所必需的。核糖體蛋白L11由N-末端和C-末端兩個結構域組成。研究表明，L11的N-末端在蛋白質合成中作為分子開關，在多肽鏈的延伸階段與EF-G相互作用對EF-G依賴的遷移過程是必需的。在肽鏈終止階段與RF1(肽鏈釋放因子)相互作用對R

2、F1識別終止密碼子UAG的功能是必需的。L11上包含有一個與具有噻唑抗性的抗生素結合的靶位點，這種結合會抑制依賴延伸因子的核糖體的活性，同時對轉錄因子的功能以及相關的反應也是相當重要的。
　　本研究從八肋游仆蟲（Euplotes octocarinatus）大核基因組中克隆到核糖體蛋白L11基因，構建了重組表達質粒pGEX-6p-1-L11，通過谷胱甘肽-Sepharose4B親和層析，純化了重組融合蛋白GST-L11。利用獲得的

3、目的蛋白制備了多克隆抗體。并研究了游仆蟲的核糖體蛋白L11與第一類肽鏈釋放因子eRF1a的體外相互作用。本研究的主要進展如下:
　　本研究根據(jù)已知的核糖體蛋白L11保守氨基酸序列設計引物，擴增克隆了該游仆蟲的核糖體蛋白基因片段，并對其核苷酸序列進行了分析。根據(jù)測得的序列設計特異性引物，并利用游仆蟲的端粒序列（C4A4C4A4C4A4C4）為引物，擴增得到基因的全序列。序列分析表明，該基因全長為709bp，編碼區(qū)由531bp組成，編

4、碼176個氨基酸，不含內(nèi)含子。該基因在GenBank登陸號為EF061066。
　　將游仆蟲的核糖體蛋白L11基因構建于原核表達載體pGEX-6p-1中，得到的重組表達質粒pGEX-6p-1-L11轉化至E.coli BL21(DE3)，IPTG誘導表達獲得融合蛋白GST-L11。表達產(chǎn)物經(jīng)谷胱甘肽-Sepharose4B親和層析得到了純化。Western blot分析表明該蛋白為融合有GST的L11蛋白。
　　通過酶切的方

5、法將融合蛋白的GST標簽切除，得到純化的目的蛋白L11。采用切膠回收的方法回收目的蛋白，并將回收產(chǎn)物免疫大鼠，制備抗體，ELISA檢測抗體效價達1∶8，000。Western blot檢測證明抗體特異性良好。該多克隆抗體為進一步研究核糖體蛋白的功能奠定了基礎。
　　分別將游仆蟲核糖體蛋白的融合蛋白GST-L11與第一類肽鏈釋放因子的融合蛋白His-eRF1a在體外進行表達，并利用其中一個蛋白與其相應的特異性親和層析作用，進行Pul