植物活性成分與DNA體外相互作用檢測技術及分子機制的研究.pdf

1、來源于植物界的活性成分如黃酮類、香豆素類、皂苷類、生物堿類、多糖類、酚酸類等具有多種藥理活性。DNA是基因表達的物質(zhì)基礎，是絕大多數(shù)具有抗癌、抗病毒等活性的藥物在生物體內(nèi)的標靶，藥物分子通過與DNA的結合，可以干擾DNA的復制從而使腫瘤及病毒細胞遭受破壞。
　　本論文通過構建多種光譜學技術包括紫外–可見吸收光譜法、熒光光譜法、圓二色譜法(CD)以及紅外光譜法(FT?IR)等與化學計量學和分子模擬結合的方法體系，在模擬人體生理酸度(

2、pH7.4)的條件下，研究了補骨脂素等幾種植物活性成分與小牛胸腺DNA(ctDNA)相互作用的結合特性與分子機制，該研究為藥物小分子與DNA的相互作用檢測提供了新的研究思路和技術平臺，同時也為從分子水平上認識藥物分子與DNA的作用機制、藥理活性及進行藥物的體外篩選提供理論基礎。
　　本文的主要研究內(nèi)容及結果如下：
　　1.概述了DNA的結構及生理特性，綜述了小分子與DNA相互作用研究方法及現(xiàn)狀。
　　2.構建基于化學計

3、量學多元曲線分辨–交替最小二乘法(MCR–ALS)與紫外、熒光、CD和FT?IR等光譜學技術以及分子模擬結合的方法體系，測定了呋喃香豆素類化合物補骨脂素(PSO)、8?甲氧基補骨脂素(8–MOP)與ctDNA的的結合性質(zhì)，并研究了其相互作用分子機制。分別將不同滴定模式下獲得的PSO或8–MOP與ctDNA作用的多個復雜紫外光譜數(shù)據(jù)矩陣進行組合，構建了一個信息量更豐富的擴展數(shù)據(jù)矩陣，利用MCR–ALS分別解析了PSO、8–MOP與ctDN

4、A相互作用的擴展紫外光譜數(shù)據(jù)矩陣，從嚴重重疊的光譜信息中獲得了目標組分(PSO、ctDNA和PSO–ctDNA或8–MOP、ctDNA和8–MOP–ctDNA)的純光譜和濃度變化趨勢，實現(xiàn)了PSO、8–MOP與ctDNA相互作用進程的定量檢測。探索了PSO或8–MOP與ctDNA之間的結合模式，發(fā)現(xiàn)PSO、8–MOP的存在都會引起KI猝滅效應的減弱、ctDNA熔點和粘度的升高，由此確定這兩種藥物均以嵌插方式作用于ctDNA的堿基。FT–

5、IR光譜分析結果顯示，PSO優(yōu)先結合于ctDNA的A堿基上，而8–MOP主要與ctDNA上的A、T堿基作用。CD光譜分析發(fā)現(xiàn)PSO、8–MOP會對ctDNA的堿基堆積和雙螺旋結構產(chǎn)生擾動，但并不會改變DNA的B型構象。分子模擬結果證實了實驗結果并直觀地展現(xiàn)了PSO、8–MOP與ctDNA的結合方式和空間結合姿態(tài)。
　　3.建立了紫外光譜法結合MCR–ALS法、三維熒光光譜法結合平行因子分析(PARAFAC)法的聯(lián)用技術，檢測了瑞香

6、素與ctDNA的相互作用及結合特性。通過MCR–ALS解析擴展的紫外–可見吸收光譜數(shù)據(jù)矩陣，同時得到瑞香素與ctDNA反應過程中3種主要組分(瑞香素，ctDNA，ctDNA–瑞香素復合物)的純光譜圖及其濃度變化曲線，定量監(jiān)控了ctDNA–瑞香素的相互作用形成復合物的過程。瑞香素對ctDNA的熔點、粘度以及KI的猝滅效應影響不明顯，且單鏈DNA猝滅瑞香素熒光的能力比雙鏈DNA強，表明瑞香素通過溝槽方式與ctDNA發(fā)生作用，PARAFAC分

7、解瑞香素與Hoechst33258競爭結合ctDNA的三維同步熒光光譜，獲得的結果進一步證實了瑞香素的溝槽結合方式。分子模擬形象地展現(xiàn)出瑞香素與ctDNA小溝區(qū)的A、T堿基作用，這種預測與紅外光譜研究結果一致。CD光譜顯示，瑞香素誘導DNA的構象由B型向A型轉(zhuǎn)變。
　　4.聯(lián)合應用MCR–ALS、多種光譜技術、ctDNA熱變性試驗、粘度測量以及DNA斷裂試驗等測試手段，研究了瑞香素與金屬銅離子的配合作用，并檢測了瑞香素銅配合物與c

8、tDNA的作用特性。結果表明，瑞香素與銅的配合比為1:1。配合物的存在可增加DNA的粘度和熔點、與溴化乙錠(EB)發(fā)生競爭，表明配合物與ctDNA之間存在嵌插結合。二者的結合作用減少了ctDNA的螺旋性和堿基堆積，因此引起了ctDNA的圓二光譜變化。FT?IR分析顯示，配合物在ctDNA上的結合位點為A、T堿基，且不會引起DNA的構象變化。此外，DNA斷裂實驗表明，配合物與DNA的結合能力較強，會導致質(zhì)粒DNA的斷裂。獲得的焓變和熵變結

9、果表明，瑞香素銅配合物與ctDNA的結合主要依靠氫鍵和疏水作用力驅(qū)動。
　　5.在生理酸度條件下(pH7.4)，運用熒光、CD、FT?IR光譜技術并結合粘度試驗和熔點測量，研究了積雪草苷與小牛胸腺DNA之間的相互作用。實驗結果顯示，DNA能明顯猝滅積雪草苷的熒光，猝滅過程為靜態(tài)猝滅。積雪草苷與DNA之間的結合使DNA的熔點升高，粘度增大，說明二者以嵌插方式結合，氫鍵和范德華力是結合反應驅(qū)動的主要作用力。CD和FT?IR光譜分析表明